Как сделать сперму в фотошопе: Как в фотошопе сделать сперму

В этом руководстве по Photoshop Ричард Харрингтон объясняет, как вывести видеосигнал DV непосредственно на видеомонитор SD из Adobe Photoshop с помощью цифрового видео конвертера через FireWire и средства управления предварительным просмотром видео.Это очень полезный инструмент для корректировки цвета … подробнее

53 Классные эффекты и уроки Photoshop Illustrator

Всегда интересно экспериментировать с различными техниками и учиться работать с различными аспектами Adobe Photoshop, чтобы оживить скучные изображения и превратить их в произведения искусства и шедевры.

Итак, если вы заинтересованы в освоении новых навыков, будь вы новичок, средний или продвинутый пользователь, эти руководства Photoshop и Illustrator для вас.

Ниже вы найдете невероятного количества удивительных красочных произведений искусства, которые вдохновят любого дизайнера. , а также мы выбрали несколько лучших руководств по Adobe, подобранных вручную, чтобы улучшить или выделить любое действие, происходящее на фотографии.

Учебные пособия по эффектам неона и свечения

Тони Ариаван покажет вам, как использовать деформацию, маски слоев и простую настройку цвета для создания высокотехнологичного вида, не похожего на этот мир.

Создайте эффект сияющего неона в своей иллюстрации, который привлечет внимание аудитории своей красотой и уникальностью.

Учебные пособия по дымовым эффектам

Как легко создать цифровой абстрактный дым с помощью Illustrator и Photoshop. Одна из лучших особенностей этой техники — то, что она очень настраиваема и вы можете делать это довольно быстро.

Как создать дым в фотошопе, от Abduzeedo.

Больше эффектов дыма

Великолепный эффект дымчатой ​​дымки в этом фрактале подчеркивается цветовыми и световыми эффектами.

Учебные пособия по созданию завихрений

Из этого туториала Вы узнаете 4 способа создания завихрений, и, смешивая их, вы научитесь некоторым очень мощным методам, которые позволят вам легко создавать множество различных стилей завихрений и сумасшедших векторов спермы.

Учебные пособия по световым эффектам

Фабио показывает нам в этом уроке, как легко и очень быстро создать светлый рисунок в Photoshop.

Как создать привлекательную графику, отображаемую на коробке Windows Vista и на некоторых их обоях / заставках.

Дополнительные световые эффекты

Учебники по текстовым эффектам

Хорошее руководство от Верле о том, как создать новый системный графический интерфейс Apple в Leopard с «эффектом вставки» в текст.

Из этого туториала Вы узнаете, как использовать Photoshop и Illustrator для создания классных «векторных линейных градиентов», чтобы придать тексту винтажный вид «старой школы».

Узнайте, как создать эффект дымной ночи для текста, чтобы придать ему жуткое сверхъестественное ощущение. Это хорошее упражнение в использовании фильтра волновых искажений.

Вот 50 лучших руководств по работе с текстом.

Эффект дополнительного текста

Уроки по винтажным эффектам

Если вы хотите мгновенно окунуться в прошлую эпоху, позволив при этом проявиться своему творчеству, немногие методы могут быть столь же универсальны, как коллаж, состоящий из винтажных элементов.

Фантастический метод создания эффекта старинного фото в Photoshop.

Другие винтажные эффекты

Учебники по различным эффектам изображения

Nik Ainley показывает вам, как создать всплеск, смешав два очень разных изображения, чтобы создать этот удивительный подводный эффект, дополненный растворяющейся фигурой человека.

В этом уроке будет показано, как сделать снимок, в данном случае женское лицо, и создать впечатление, что оно полностью состоит из векторных фигур.

Дополнительные эффекты для изображений

Учебники по эффектам акварели

Как создать меню с эффектом акварели в Photoshop.

Как создать эффект ручной росписи и акварели.

Разные обучающие программы и эффекты

Как использовать эффект складывания и раздувания

Как создать линии сливающейся волны с помощью инструмента Смешение в Illustrator.

Узнайте, как создать букет из тропических цветов.

Впечатляющее руководство по созданию плаката для концерта.

Как создать «Эффект сияния», используя стили слоя в Photoshop. Создав стиль слоя, вы можете легко «придать блеск» любому слою. Также есть видеоурок.

Некоторые изящные приемы, инструменты, техники и настройки, которые позволят вам в кратчайшие сроки создавать идеальные круглые конструкции с помощью Illustrator.

Оставьте свой след яркими, но простыми формами и смелыми, легко читаемыми губами: Данило Родригес покажет вам, как это сделать.

Узнайте, как нарисовать «модные круги» и просто применить к ним цвет.

Как создавать цветные линии радуги.

Как создать или имитировать эффект естественной зернистости пленки на фотографиях в Photoshop CS3.

Вот пошаговое руководство по воссозданию этого эффекта.

Этот урок включает 9 техник Photoshop, которые покажут вам, как добавить больше глубины, цвета, контраста и текстуры в вашу векторную графику.

Портфолио для вдохновения

Ищете вдохновение, ищите талантливых и креативных дизайнеров, которые овладели этими методами, и учатся у них. Ниже вы найдете удивительные портфолио для художников, которые умеют просто быть креативными.

Эта статья изначально опубликована 4 мая 2008 г. и обновлена ​​6 августа 2020 г.

CatSper опосредует хемотаксическое поведение и подвижность асцидийных сперматозоидов

Abstract

Подвижность сперматозоидов, включая хемотаксическое поведение, регулируется изменениями внутриклеточной концентрации Ca ²⁺ . Катионный канал сперматозоидов (CatSper) играет важную роль в регуляции внутриклеточной концентрации Ca ²⁺ . У млекопитающих CatSper является единственным каналом Ca ²⁺ , который функционирует в сперматозоиде, а мыши, у которых отсутствуют гены субъединиц CatSper, которые составляют область пор канала Ca ²⁺ , бесплодны из-за к подавлению гиперактивации сперматозоидов.Также считается, что CatSper участвует в хемотаксисе морских ежей. Напротив, в асцидии, Ciona Кишечник , фактор активации и притяжения сперматозоидов (SAAF) взаимодействует с Ca ²⁺ / АТФазой, которая является насосом Ca ²⁺ . Хотя сообщалось о существовании генов CatSper , неясно, является ли CatSper специфическим каналом Ca ²⁺ , который функционирует в асцидийных сперматозоидах. Таким образом, в этом исследовании мы получили животных с нокаутом по Catsper3 (KO), которые обнаружили, что они были значительно менее подвижными, с небольшим количеством подвижных сперматозоидов, не проявляющих хемотаксического поведения.Эти результаты предполагают, что CatSper играет важную роль в сперматогенезе и основных механизмах подвижности сперматозоидов как у асцидий, так и у млекопитающих.

Введение

Ca ²⁺ играет важную роль во многих клеточных событиях. В процессе оплодотворения Ca ²⁺ играет незаменимую роль, контролируя многие функции сперматозоидов, включая активацию подвижности сперматозоидов, хемотаксис сперматозоидов, способность и гиперактивацию подвижности, а также реакцию акросомы (1,2).В частности, Ca ²⁺ регулирует характер биения жгутиков (3,4) и направление плавания сперматозоидов (5). Концентрация внутриклеточного Ca ²⁺ ([Ca ²⁺ ] _i ) регулируется притоком Ca ²⁺ через каналы Ca ²⁺ и оттоком Ca ²⁺ , управляемым Ca ^{2+ Теплообменник} или насосы Ca ²⁺ ; следовательно, оба канала Ca ²⁺ и насосы Ca ²⁺ играют важную роль в функциях сперматозоидов.

У асцидий увеличение [Ca ²⁺ ] _i также влияет на подвижность сперматозоидов и хемотаксическое поведение по отношению к яйцеклетке (5–7). Сульфат-конъюгированный гидроксистероидный фактор, активирующий и привлекающий сперматозоиды (SAAF), действует как активатор и аттрактант сперматозоидов у асцидий (8,9). Сперматозоиды, демонстрирующие хемотаксическое поведение, демонстрируют временное увеличение [Ca ²⁺ ] _и в жгутиках (всплески Ca ²⁺ ), когда концентрация SAAF снижается до локального минимума, образуя асимметричную жгутиковую волну сперматозоидов. и вызывает серию движений сперматозоидов, состоящую из поворота и прямого плавания (5,6,10).Регуляция [Ca ²⁺ ] _i с помощью SAAF в основном достигается за счет контроля оттока Ca ²⁺ , который связывается и активирует Ca ²⁺ / АТФазу (PMCA) на плазматической мембране сперматозоидов, что представляет собой насос Ca ²⁺ , ответственный за отток Ca ²⁺ (11). Однако конкретные молекулы, участвующие в притоке Ca ²⁺ , остаются неизвестными, хотя участие каналов Ca ²⁺ , управляемых магазином, было предложено в фармакологических исследованиях (6).

Среди многих систем, регулирующих Ca ²⁺ , канал Ca ²⁺ на плазматической мембране является важным игроком для притока Ca ²⁺ . В сперматозоидах млекопитающих катионный канал сперматозоидов (CatSper), который является специфическим для сперматозоидов Са ²⁺ каналом, играет решающую роль в регуляции функции сперматозоидов. CatSper — это канал, который имеет общую гомологию с потенциалозависимым каналом Ca ²⁺ (12), состоящим из четырех порообразующих субъединиц (CatSper 1, 2, 3, 4) (13–15) и нескольких вспомогательных субъединиц (CatSper β, γ, δ, ε, ζ и EFCAB9) (16–19).CatSper находится в жгутике сперматозоидов и опосредует гиперактивацию (12,15,20,21). Кроме того, CatSper, по-видимому, является единственным каналом Ca ²⁺ , который работает в сперматозоиде млекопитающих (22), поэтому считается, что он опосредует не только гиперактивацию, но также биение жгутиков и паттерны плавания (23).

В отличие от своей решающей роли у млекопитающих, CatSper отсутствует у многих животных, включая позвоночных: птиц, земноводных и многих костистых рыб, у которых отсутствует ген CatSper (24).Более того, уровни экспрессии и функции белков CatSper у животных, кроме млекопитающих, были плохо изучены; однако CatSper, по-видимому, регулирует хемотаксис сперматозоидов у морских ежей (25). Более того, геномная база данных асцидии, Ciona Кишечник , состоит из всех порообразующих изоформ CatSper (CatSper1-4), аналогичных млекопитающим (24).

Поскольку CatSper представляет собой сложный белок с множеством субъединиц, он еще не был успешно экспрессирован функционально в культивируемых клетках (18).Существует только одно исследование, в котором домен датчика напряжения CatSper3 был экспрессирован в клетках HEK293T и ооцитах Xenopus (26). Таким образом, функциональный анализ CatSper выполняется с использованием сперматозоидов от животных с дефицитом генов, при этом большинство исследований проводится на мышах. В этом исследовании мы изучили роль CatSper в идентификации ключевого игрока, участвующего в притоке Ca ²⁺ во время хемотаксиса сперматозоидов, а также исследовали специфические роли CatSper у асцидий.Интересно, что экспрессия CatSper в сперматозоиде асцидии не ограничивалась жгутиком сперматозоида, но также наблюдалась в головке сперматозоида и других клетках. Кроме того, мы разработали асцидийную сперму с дефицитом Catsper3 с использованием системы CRISPR / Cas9 и обнаружили, что CatSper также является незаменимым каналом Ca ²⁺ в асцидийной сперме. Следовательно, CatSper играет важную роль как в хемотаксисе, так и в подвижности сперматозоидов. CatSper также может играть важную роль в развитии спермы и сперматогенезе.

Результаты

Экспрессия CatSper в асцидии

Первоначально мы исследовали экспрессию CatSper в асцидии C. кишечник с помощью ОТ-ПЦР. Удивительно, но у взрослых все подтипы Catsper ( Catsper1, 2, 3, 4, ) экспрессировались не только в яичках, но и в сердце (рис. 1A). Экспрессия генов Catsper также наблюдалась в желудке и кишечнике; однако это может быть связано с тем, что ткань яичек существует в форме, которая плотно прилегает к поверхности желудка и кишечника, что затрудняет полное удаление яичек во время сбора ткани.Кроме того, Catsper3 и Catsper4 экспрессировались в сифоне и жабрах. Когда экспрессия Catsper была исследована у молодых особей, находящихся в стадии развития, Catsper3 и Catsper4 были экспрессированы у 2,5-недельных молодых особей, хотя экспрессия была слабой (Рисунок 1B). Молодь 2,5-недельного возраста еще не созрела, и семенники на этой стадии не развиваются. Таким образом, экспрессия Catsper в асцидии, по-видимому, не ограничивается семенником.С другой стороны, при полной гибридизации in situ (WISH) экспрессия Catsper не была обнаружена у молодых особей и наблюдалась только во взрослых семенниках (рис. 2). Эти результаты показывают, что гены асцидии Catsper в основном экспрессируются в семенниках, как и у млекопитающих, но слабо экспрессируются в других местах, кроме семенников.

Уровни экспрессии генов Catsper в асцидии, Ciona Кишечник , в тканях зрелых взрослых особей (A) и развивающихся молодых особей (B).Уровни экспрессии домашнего гена, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( Gapdh ), использовали в качестве контроля. Экспрессию генов проверяли с помощью ОТ-ПЦР. Стрелки указывают полосы, относящиеся к продуктам ОТ-ПЦР.

методом полной гибридизации in situ (WISH) был использован для анализа уровней экспрессии Catsper1 Catsper2 и Catsper3 в желудке и семенниках молодых и взрослых асцидий. Ни один из подтипов Catsper не экспрессировался у молодых особей.Они были выражены только в семенниках взрослых (черная стрелка). Для положительного контроля WISH использовали зонд Трипсиноподобный (XP_002126930.1) (белая стрелка).

CatSper 3 был локализован вокруг митохондрий асцидиевой спермы

Затем мы исследовали существование белков CatSper. Как описано выше, гены ascidian Catsper в основном экспрессируются в семенниках, но также слабо экспрессируются в сердце, сифоне и жабрах. Таким образом, мы исследовали, присутствуют ли белки CatSper в этих тканях.У видов млекопитающих белки CatSper наблюдались только в жгутиках сперматозоидов. С другой стороны, в асцидии белок CatSper 3 был высоко экспрессирован в сперматозоидах (рис. 3). Интересно, что иммуногистохимия показала, что CatSper3, по-видимому, экспрессируется в сперматогониях и головной области сперматозоидов в семенных канальцах и в интерстициальных клетках, подобных клеткам Лейдига, за пределами семенных канальцев (рис. 4, верхний и средний ряд). Точное наблюдение за сперматозоидами показало, что CatSper 3 локализован не только в жгутиках, но и вокруг митохондрий в головке асцидии сперматозоида (рис. 5).

Типичные результаты вестерн-блоттинга сперматозоидов и семенников от двух животных с нокаутом Catsper3 (KO) с использованием антитела против CatSper3. Асцидиевый белок CatSper3 дикого типа показал полосу 50 кДа (стрелка), в то время как прогнозируемый размер на основе выведенной аминокислотной последовательности составлял 49809 Да.

Иммуногистохимия с антителом против CatSper3 в семенниках асцидии. CatSper, по-видимому, локализуется в клетках Лейдига в развивающихся сперматозоидах.Масштабная линейка = 50 мкм.

Непрямой иммунофлуоресцентный анализ с антителом против CatSper3 в асцидиевой сперме. (вставка) Увеличенное изображение головки сперматозоида. Белок CatSper, по-видимому, локализован в митохондриальной области головы, а также в жгутике. Масштабная линейка = 10 мкм или 1 мкм (вставки).

Развитие задерживается у животных с нокаутом Catsper3

Чтобы изучить функцию канала CatSper в асцидиевой сперме, мы попытались получить Catsper-дефицитный асцидиан с помощью системы CRISPR / Cas9.Мы выбрали экзон 5 из Catsper3 в качестве целевого гена системы CRISPR / Cas9 (рис. 6A), потому что мы не смогли найти эффективный целевой сайт для системы CRISPR / Cas9 на других асцидийных генах Catsper. Частота мутаций гена Catsper3 системой CRISPR / Cas9 составила 94,7% (n = 38) при проверке на ювенильной стадии.

Поколение Catsper3 КО асцидий. (A) ДНК и аминокислотные последовательности Catsper3 . Целевая последовательность для системы CRISPR / Cas9 выделена жирным красным шрифтом.(B) Репрезентативные последовательности ДНК вокруг целевой последовательности асцидий Catser3 KO с системой CRISPR / Cas9. Последовательность ДНК не заглушенного дикого типа Catsper3 показана в верхнем ряду (дикий тип). Жирными красными буквами обозначена целевая последовательность для системы CRISPR / Cas9. Удаленные и вставленные нуклеотиды показаны тире и синей буквой соответственно.

К сожалению, животные F ₀ , у которых ген Catsper3 был отредактирован системой CRISPR / Cas9 (животные Catsper3 KO), имели тенденцию умирать, когда их личинки головастиков оседали и превращались в молодых.Кроме того, скорость роста животных Catsper3 KO была намного медленнее, чем у контрольных животных; Размер тела двухмесячных особей был значительно меньше, чем у животных дикого типа (рис. 7). Наконец, мы получили девять животных нокаутов, достигших репродуктивной зрелости (рис. 6В). Поскольку гаметы животных KO не могли оплодотворяться, мы использовали животных KO для следующих анализов.

Размеры тела животных Catsper3 КО и дикого типа (WT).Исследуемые животные КО и WT были в возрасте 60–74 дня и 47–75 дней соответственно. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение (S.D). Число в скобках обозначает количество исследованных животных. Наблюдалась значительная разница между животными дикого типа и нокаутом, как определено с помощью t-критерия Стьюдента. ** P <0,01.

Сперматогенез животных с нокаутом Catsper3

В сперме, полученной от животных CatSper3 KO, все еще наблюдался белок CatSper3, и иммуногистохимия с использованием антитела против CatSper3 показала, что CatSper3 был локализован на головке сперматозоида в семенных канальцах (рис. , нижний ряд).Однако белок, по-видимому, был модифицирован: полоса прореагировавшего антителом при вестерн-блоттинге была видна при 90 и 70 кДа, что было выше, чем у белка CatSper3 дикого типа, и на 45 кДа, что было ниже, чем у белка CatSper3 дикого типа. (Рисунок 3C). Более того, сигнал CatSper3 в интерстициальных клетках, подобных клеткам Лейдига, был сильнее, чем в сперматозоидах (стрелка).

Семенники животных CatSper3 KO были меньше, чем у животных дикого типа того же возраста, что согласуется с плохим развитием особей.Сперматогенез, по-видимому, происходил нормально у животных KO (рис. 8, верхний и средний ряд), что давало зрелые сперматозоиды, форма которых оказалась нормальной. Однако сперматозоиды от животных КО были хрупкими; Сперматозоиды без головы или со сломанными жгутиками часто наблюдались под микроскопом (рис. 8, нижний ряд).

Гистологическая оценка семенников и сперматозоидов асцидий Catsper3 KO. Нижний (верхний ряд) и верхний (средний ряд) увеличение среза яичек, взятых у асцидий дикого типа и Catsper3 КО и окрашенных гематоксилином и эозином.Стрелки указывают на сперматозоиды, произведенные в яичках. (Нижний ряд) Сперматозоиды, полученные из семяпроводов дикого типа и асцидий Catsper3 и КО. Некоторые сперматозоиды животного КО потеряли голову или сломали жгутик (черные стрелки). Типичные головки сперматозоидов дикого типа обозначены белыми стрелками. Масштабная линейка = 50 мкм.

Подвижность сперматозоидов и хемотаксическое поведение животных с нокдауном Catsper3

Как описано выше, сперматозоиды от животных KO выглядели хрупкими, и часто наблюдались сперматозоиды без головы или со сломанными жгутиками (рис. 8, нижний ряд).Сперма казалась нормальной по форме, и почти все сперматозоиды не имели подвижности даже в присутствии теофиллина, который является активатором подвижности асцидиевых сперматозоидов (дополнительные фильмы S1 и S2). Некоторые сперматозоиды демонстрировали подвижность вперед, и казалось, что у них была большая боковая амплитуда головки (дополнительный ролик S2, рис. 9), похожая на движение сперматозоидов в присутствии ингибитора PMCA (11). Кроме того, ни один из сперматозоидов не показал хемотаксической реакции (Рисунок 9).

Хемотаксическое поведение сперматозоидов с нокаутом Catsper3.(Верхний ряд) Типичные три траектории сперматозоидов Catsper3 KO и животных дикого типа, взвешенных в морской воде вокруг кончика капилляра, содержащего 5 мкМ активирующего и привлекающего сперматозоиды фактора (SAAF). Начало координат указывает на кончик капилляра. (Средний ряд) Изменения расстояния между кончиком капилляра и головкой плавающей спермы. Линии представляют собой линейное уравнение времени и расстояния. Индекс хемотаксиса (LECI) рассчитывается как отрицательные значения коэффициентов в уравнении.(Нижний ряд) Индекс хемотаксиса (LECI) сперматозоидов. Контроль CRISPR — это данные о сперматозоиде животного, которому вводили Cas9 и гРНК, но не обнаруживали никаких генетических мутаций (n = 1). Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая значимость установлена ​​на уровне ** P <0,01 (t-критерий Стьюдента).

Обсуждение

За 20 лет, прошедших с момента открытия CatSper в качестве специфичного для сперматозоидов канала Ca ²⁺ (12), многие исследования показали, что CatSper является единственным важным каналом Ca ²⁺ , который функционирует в сперматозоидах в млекопитающие (27).CatSper локализуется в линейных четырехугольных нанодоменах вдоль жгутика в сперме млекопитающих и обеспечивает реотаксическое поведение в женских половых путях (18,28). С другой стороны, у многих животных, включая птиц и земноводных, отсутствует ген CatSper (24), и неизвестно, выполняет ли CatSper те же функции в сперматозоидах других животных, кроме млекопитающих, хотя только у морского ежа CatSper, по-видимому, опосредует хемотаксию. поведение в фармакологических исследованиях (29). Асцидиан C. Кишечник принадлежит к хордовым и имеет четыре изоформы CatSper (CatSper1-4), аналогичные млекопитающим.Интересно, что CatSper, по-видимому, не ограничивается спермой, и наше исследование показало, что экспрессия CatSper в асцидии не ограничивалась семенниками, но также наблюдалась в незрелых молодых и взрослых сердцах, несмотря на сильную экспрессию генов CatSper. наблюдалась в яичке (рис. 1). Распределение CatSper в сперматозоидах асцидии также отличается от распределения в сперматозоидах млекопитающих: в сперматозоидах асцидии CatSper3 располагается на жгутике и митохондриальной области головы (Рисунок 5).Более того, большинство асцидий Catsper3-KO умерло в течение месяца из-за задержки роста, а размер тела взрослых асцидий Catsper3-KO был значительно мал. Эти данные предполагают, что CatSper играет роль в развитии и / или усвоении питательных веществ. Хотя область экспрессии CatSper3 в органах, отличных от семенников, все еще не исследована, реснички, по-видимому, иммунореактивны по отношению к антителу против CatSper3. Таким образом, CatSper может экспрессироваться в ресничках и жгутиках не только в сперматозоиде, но также и во всем теле, и может играть роль в движении ресничек / жгутиков.

Форма сперматозоидов, полученных от асцидий Catsper3-KO, была почти нормальной, но у некоторых животных она выглядела ненормальной, с маленькой головкой, и они были хрупкими: головка легко отделялась от жгутика (рис. 8). Более того, сперматозоиды были почти неподвижными и никогда не активировались никакими стимуляциями. У некоторых сперматозоидов была подвижность, но они не проявляли хемотаксического поведения. У мышей нет морфологических различий между спермой дикого типа и спермой CatSper-KO в любой субъединице (12,15–19,30).С другой стороны, сперматогенез у самцов Catsper3-KO не отличался от такового у дикого типа (рис. 8). Являются ли морфологические аномалии сперматозоидов следствием аномального сперматогенеза или недостаточного питания, вызванного расстройствами пищевого поведения, в будущем потребуется более подробный анализ.

Сперма CatSper-KO не показала никакого ответа на SAAF, и хемотаксического поведения не наблюдалось. Этот результат согласуется с фармакологическими данными о хемотаксисе сперматозоидов у морского ежа Arbacia punctulata (25).У млекопитающих сперматозоиды без CatSper подвижны, но не могут проявлять гиперактивацию, что приводит к бесплодию (12,15). Следовательно, вероятно, что CatSper участвует в регуляции подвижности жгутиков у асцидий, морских ежей и млекопитающих. Предполагается, что у млекопитающих CatSper является прямой или косвенной мишенью для различных химических веществ и участвует в хемотаксисе (31). Было показано, что у человека прогестерон, который является предполагаемым аттрактантом спермы млекопитающих, активирует CatSper путем связывания с белком 2, содержащим α / β гидролазный домен (32).Кроме того, субъединицы CatSper, EFCAB9 и Catsperζ регулируют открытие каналов CatSper в ответ на изменения внутриклеточного Ca ²⁺ и pH (19). С другой стороны, в асцидии аттрактант сперматозоидов SAAF напрямую связывается с PMCA и, по-видимому, индуцирует отток Ca ²⁺ из сперматозоидов (11). Более того, в асцидии сперматозоиды с дефицитом CatSper не только не обладали хемотаксическим поведением, но также оказывали значительное влияние на саму подвижность, при этом многие сперматозоиды не могли инициировать движение.У млекопитающих сперматозоиды без какой-либо порообразующей субъединицы CatSper имеют такую ​​же начальную скорость, что и сперматозоиды дикого типа (15), и сперматозоиды CatSperζ-null и EFCAB9-null также подвижны, хотя и демонстрируют аномальные формы волны жгутиков (18,19). Таким образом, система, регулирующая биение жгутиков сперматозоидов, включая канал CatSper, по-видимому, отличается от системы млекопитающих, хотя система в основном регулируется [Ca ²⁺ ] _i : CatSper также является незаменимым каналом Ca ²⁺ в асцидиевой сперме, но он играет роль не только в биении жгутиков сперматозоидов, но и в фундаментальной подвижности сперматозоидов.

В заключение, результаты этого исследования показывают, что CatSper играет важную роль в асцидии сперматозоидов. В отличие от млекопитающих, CatSper, по-видимому, участвует не только в регуляции биения жгутиков сперматозоидов, но также и в подвижности сперматозоидов у асцидий. Более того, экспрессия CatSper в асцидии не ограничивалась жгутиком сперматозоидов и наблюдалась также у незрелых молодых особей, взрослых сердец, клеток Лейдига и головок сперматозоидов. CatSper также может играть роль в развитии сперматозоидов и сперматогенезе.Хотя CatSper, по-видимому, играет более важную роль у асцидий, чем у млекопитающих, это может быть связано только с нарушением сперматогенеза; однако для подтверждения этого необходимы дальнейшие исследования. Мы также стремимся продолжить изучение различных ролей CatSper в будущих исследованиях.

Экспериментальные процедуры

Материалы

Асцидиан C. Кишечник (тип A; также называемый C. robusta ) был получен в рамках проекта National BioResource для Ciona (http: // marinebio.nbrp.jp/). Сперму асцидии получали, как описано ранее (33). Искусственная морская вода содержала 462 мМ NaCl, 9 мМ KCl, 10 мМ CaCl2, 48 мМ MgCl2 и 10 мМ HEPES-NaOH (pH 8,2). SAAF и его производные были синтезированы, как описано ранее (9,34). Молодь была выведена путем искусственного осеменения с использованием зрелых яиц и спермы, полученной из рассеченных гоноводов. Образцы цельной молоди и вскрытые взрослые особи были подготовлены для гибридизации in situ, как описано Накаямой и Огасавара (35).

Реагенты, конкретно не упомянутые в тексте, были приобретены у FUJIFILM Wako Pure Chemicals (Осака, Япония).

ОТ-ПЦР

Прогнозируемые Гены Catsper были идентифицированы из базы данных геномов C. кишечника (http://ghost.zool.kyoto-u.ac.jp/cgi-bin/gb2/gbrowse/kh /). Суммарную РНК экстрагировали из каждого образца с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия), и концентрацию РНК определяли по поглощению при 260 нм по отношению к поглощению при 280 нм.Один микрограмм общей РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Tokyo Japan) с использованием праймера заякоренного олиго (dT) 18 и праймера случайного гексамера. 50 мкл реакционной смеси содержали 32 мкл воды, свободной от нуклеаз, 1,0 мкл кДНК, 1,5 мкл (10 мкмоль / л) каждого праймера, 5 мкл (2 мМ) дНТФ, 3 мкл (25 мМ) MgSO4, 5 мкл (10х) Буфер KOD plus версии 2 и 1 мкл KOD plus (TOYOBO, Осака, Япония). Были использованы следующие праймеры: Catsper1 (KH.C10.377): 5’-TCACACAGCATGGAC GGTAA-’3 и 5’-GCATCAGGATTGCTCCTAAAGA-’3; Catsper2 (KH.S391.7): 5’-CGCCCAAGTATCATCCTGAA-’3 и 5’-GACATGTACTTAATAGTGGCAACACC-’3; Catsper3 (KH. C2.323): 5’-CGAAAGCGAAGTTTTTAATGGTCT-’3 и 5’-GCACTTCCTTATAAGCCATGTGTAA-’3; Catsper4 (KH.C2.993): 5’-AGGAAGAACAGCGGTCGAAG-’3 и 5’-CTGAGGCTTCAGAGCATCCA-’3; и Gapdh: 5’-ACCCAGAAGACAGTGGATGG-’3 и 5’-CAGGACACCAGCTTCACAAA-’3. Цикл амплификации был следующим: денатурация при 94 ° C в течение 2 мин, затем 30 циклов денатурации при 98 ° C в течение 10 с, отжиг при 55 ° C в течение 30 с и при 68 ° C в течение 1 мин.Продукты ПЦР анализировали на 2% (мас. / Об.) Агарозных гелях, окрашенных бромидом этидия 0,5 мкг / мл и визуализированных в УФ-свете. Изображения гелей были получены с использованием устройства формирования изображений гелей (Printgraph, AE-6932; ATTO, Токио, Япония), а полученные изображения были обработаны с использованием Adobe Photoshop и Adobe Illustrator (Adobe Systems, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Полная гибридизация in situ

Меченные дигоксигенином антисмысловые РНК-зонды для генов Ciona Catsper были синтезированы из амплифицированной кДНК, присоединенной к промотору Т7-РНК-полимеразы, и зонды были очищены с помощью центробежной ультрафильтрации, как описано ранее (36) .WISH был выполнен на образцах Ciona с использованием «InSitu Chip», как описано Ogasawara et al. (37). Сигналы экспрессии генов визуализировали с использованием растворов нитросинего тетразолия / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата стандартным методом (Roche). Цельные и разрезанные образцы Ciona наблюдали с помощью стереомикроскопа SZX12 (Olympus, Токио, Япония).

Нокдаун гена системой CRISPR / Cas9

Метод CRISPR / Cas9 (38,39) использовался для редактирования генома в C.кишечник , как описано ранее (40). Мы разработали целевые последовательности гРНК, которые специфичны для Catsper3 (5’-CGAAAGCGAAGTTTTTAATGGTCT-3 ’) в пятом экзоне, используя ZiFiT (http://zifit.partners.org/ZiFiT) (41,42). Целевые ДНК вставляли в сайт BsaI pDR274 (Addgene; 39) в качестве векторов для транскрипции in vitro гРНК. Ген Cas9 , подаренный Джорджем Черчем (hCas9) (плазмида Addgene # 41815; http://n2t.net/addgene:41815; RRID: Addgene_41815) (43), был субклонирован в pCS2 + в качестве вектора для in vitro транскрипция мРНК.гРНК и мРНК Cas9 были синтезированы с использованием наборов для транскрипции MEGAshortscript T7 и MEGAshortscript SP6 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA) соответственно.

Мы вводили приблизительно от 30 до 100 мкл раствора РНК, содержащего 400 нг / мкл мРНК, 800 нг / мкл мРНК Cas9 и 10% фенолового красного, в неоплодотворенные яйца и выращивали эмбрионы и животных в аквариумах.

Мы извлекли ДНК из молодых особей или мускулов взрослых особей и провели ПЦР для определения эффективности редактирования генома с помощью анализа подвижности гетеродуплекса (44).Праймеры, использованные для ПЦР, были: 5’-TTGACTGCTCTCATAGACACGATG-3 ’и 5’-TTACCGTAACGAAGCTGAAGAGC-3’. После очистки полос ПЦР электрофорезом продукты ПЦР субклонировали в pGEM-T Easy (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для анализа секвенирования с использованием генетического анализатора (ABI 3130; Thermo Fisher Scientific).

Вестерн-блоттинг

Образцы непосредственно солюбилизировали в буфере для образцов NuPAGE LDS (Novex, Карлсбад, Калифорния, США). Солюбилизированные образцы обрабатывали нуклеазой бензоназы (Novagen, Billerica, MA, USA), и белки разделяли с помощью гелевой системы NuPAGE SDS-PAGE с использованием 3-8% трис-ацетатных гелей (Novex) и переносили на мембраны из PVDF.Для обнаружения использовали антитело против CatSper3 (ab197924; Abcam, Токио, Япония), конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела против IgG кролика (GE Healthcare Japan, Токио, Япония) и ECL Prime (GE Healthcare Japan). CatSper. Люминесценцию регистрировали с помощью гелевого имидж-сканера (EzCapture II; ATTO). Полученные изображения обрабатывались с помощью программ Photoshop и Illustrator (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Непрямая иммунофлуоресценция

Суспензию сперматозоидов помещали на покровное стекло, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут и дважды промывали ASW в течение 5 минут.Фиксированные сперматозоиды подвергали проницаемости 0,1% NP-40 в течение 15 минут, блокировали 1% BSA в течение 1 часа и инкубировали с 0,6 мкг / мл моноклональных антител против α тубулина (# 236-10501; Thermo Fisher Scientific) или 4,3 мкг. / мл антитела против CatSper3 с 1% BSA в PBS в течение ночи. Сперматозоиды трижды промывали PBS и инкубировали с x1 / 2000 Alexa 488-конъюгированным антимышиным IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific) или x1 / 2000 DyLight550-конъюгированным против кроличьего IgG (Abcam) в течение 30 мин. После двукратной промывки PBS сперматозоиды наблюдали и получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (FV3000; Olympus).

Иммуногистохимия

Семенники препарировали и фиксировали в фиксаторе Буэна, состоящем из 71,4% насыщенной пикриновой кислоты, 23,8% формалина и 4,7% уксусной кислоты, в течение 2 часов при комнатной температуре. Ткани залили парафином и разрезали на срезы толщиной 4 мкм. Некоторые срезы окрашивали гематоксилином и эозином для морфологического наблюдения и превращали в постоянные образцы. Для иммуногистохимического анализа антигены извлекали нагреванием в цитратном буфере (pH 6.0). Срезы инкубировали с 10% козьей сывороткой (Nichirei, Токио, Япония) в качестве блокирующего раствора и инкубировали с 0,6 мкг / мл монохронного антитела против α тубулина (# 236-10501; Thermo Fisher Scientific) или 4,3 мкг / мл антибиотика. -CatSper3 антитело с 10% козьей сывороткой (Nichirei) в течение ночи. Затем срезы промывали и инкубировали с x1 / 2000 Alexa 488-конъюгированным антимышиным IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific) или x1 / 500, Alexa Fluor 546-конъюгированным против кроличьего IgG (H + L) ( Thermo Fisher Scientific) на 1 час.После трехкратной промывки PBS срезы закрепляли с помощью ProLong ™ Gold Antifade Mountant с DAPI (Thermo Fisher Scientific). Срезы тканей наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (IX-71; Olympus). Изображения записывались на ПК, подключенный к цифровой CCD-камере (Retiga Exi; QImaging, Surrey, Canada) с использованием приложения для обработки изображений (TI workbench) (45). Полученные данные обрабатывались с помощью Adobe Photoshop и Adobe Illustrator (Adobe).

Анализ подвижности сперматозоидов и хемотаксиса

Хемотаксис сперматозоидов исследовали, как описано ранее (5).Вкратце, сперму разбавляли в 10 ⁴ –10 ⁵ раз в ASW 1 мМ теофиллином (Sigma-Aldrich Japan, Токио, Япония), чтобы вызвать активацию подвижности (7). Суспензию активированных сперматозоидов помещали в камеру для наблюдения и регистрировали движение сперматозоидов вокруг наконечника микропипетки, содержащего SAAF. Положение головки сперматозоида определяли с помощью программного обеспечения Bohboh (BohbohSoft, Токио, Япония) (46). Параметры хемотаксической активности, включая траекторию, расстояние между кончиком капилляра и спермой, и LECI рассчитывались, как описано ранее (8).

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли не менее трех раз с разными образцами. Данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистическая значимость на рис. 7 и 9 была рассчитана с использованием теста Стьюдента t . Р <0,01 считали статистически значимым.

Доступность данных

Все данные содержатся в рукописи.

Вспомогательная информация

Эта статья содержит вспомогательную информацию.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантом для MY от Японского общества содействия науке (JSPS) KAKENHI (20K06715).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов в отношении содержания этой статьи.

Вспомогательная информация

Дополнительный фильм S1. Поведение сперматозоидов дикого типа вокруг капилляра, содержащего 1 мкМ фактор активации и притяжения сперматозоидов (SAAF).

Дополнительный фильм S2. Поведение сперматозоидов с нокаутом (KO) Catsper3 вокруг капилляра, содержащего 1 мкМ SAAF.

Благодарности

Мы благодарим проф.Т. Миура за разрешение использовать CLSM. Мы также благодарим г-на Х. Кохцуку, г-жу Н. Ито, г-жу М. Кавабату и г-жу М. Кохцуку (MMBS, Токийский университет) за их техническую помощь. Мы также благодарим г-на С. Накаяму за его техническую помощь в гибридизации in situ . Мы также хотели бы поблагодарить Национальный проект биоресурсов Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED) за предоставленные материалы, используемые в этом исследовании.

Аббревиатуры

CatSper

катионный канал сперматозоидов

KO

нокаут

LECI

индекс хемотаксиса на основе уравнения лайнера

PMCA

тип плазмы ATPCA

Ca-Menbrane 2

Ca7

фактор активации и связывания сперматозоидов

WISH

целиком in situ гибридизация

На этой неделе в сексе: новые исследования влечения сперматозоидов и яйцеклеток, виагры и рака кожи, а также Facebook и изображения тела

Эта неделя в сексе — это еженедельный обзор новостей и исследований, касающихся сексуального поведения, сексуального просвещения, контрацепции, ИППП и многого другого.

Почему сперма и яйцеклетка притягиваются друг к другу?

Итак, мы все знаем основную историю оплодотворения. У мужчины есть сперма. У женщины есть яйца. Мужчина и женщина занимаются сексом. Его сперма подплывает к ее яйцеклетке, появляется одна счастливая сперма , и вуаля, у нас есть зигота.

Что ж, очевидно, это не только не так просто, но до сих пор никто точно не знал, что произошло между ними, потому что исследователи еще не определили, что именно привело сперму к яйцеклетке и как они прикрепились друг к другу.

Секс. Аборт. Родительство. Мощность.

Последние новости, доставленные прямо на ваш почтовый ящик.

ПОДПИСАТЬСЯ на

Половина головоломки была разгадана в 2005 году, когда японские ученые обнаружили молекулу, выступающую из поверхности сперматозоидов млекопитающих, которая стыковалась с поверхностью яйцеклеток. Они назвали молекулу Идзумо в честь японского брачного храма.

С тех пор ученые всего мира пытались выяснить другую сторону уравнения — белок на поверхности яйца, который прилипает к Идзумо.В статье, только что опубликованной в самом последнем выпуске Nature , говорится, что они, , наконец, могут объяснить это. Группа исследователей из Института Сэнгера Wellcome Trust в Великобритании обнаружила, что белок, называемый рецептором фолиевой кислоты 4, отвечает за подключение к Изумо и начало процесса оплодотворения. Они предлагают переименовать белок Юнону в честь римской богини плодородия и брака. У Юноны есть и другая роль — он исчезает с поверхности яйцеклетки в течение 30-40 минут после оплодотворения, что предотвращает попадание в яйцеклетку более одного сперматозоида.Зигота с более чем одним сперматозоидом будет иметь слишком много хромосом и не сможет нормально развиваться.

Что особенно интересно в этих открытиях, так это открытие, что без Juno не может произойти оплодотворение. Самки мышей без Юноны были здоровы, но не могли воспроизводить потомство. Исследователи считают, что это имеет непосредственные последствия для лечения бесплодия. Женщины, у которых возникают проблемы с беременностью, могут быть проверены на наличие Юноны. Те, у кого его нет, могут пропустить другие виды лечения бесплодия и сразу перейти к внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов, при которой одна сперматозоид вводится непосредственно в яйцеклетку.Однако до сих пор не ясно, скольким женщинам не хватает Юноны.

Исследователи также считают, что это открытие может привести к новым формам контрацепции, которые блокируют Юнону и / или Идзумо, , тем самым предотвращая оплодотворение.

Виагра может повысить риск развития меланомы у мужчин

С момента появления на рынке в 1998 году было выписано 23 миллиона рецептов на маленькие синие таблетки, которые могут помочь при эректильной дисфункции (ЭД). Непосредственные побочные эффекты Виагры и других подобных препаратов от ЭД включают головные боли, приливы, расстройство желудка, заложенность носа, головокружение и проблемы со зрением, такие как видимость синего тумана, повышенная яркость или временная потеря зрения.Конечно, самым известным побочным эффектом может быть эрекция, продолжающаяся четыре часа или дольше, о чем предупреждают в каждой рекламе. На самом деле это болезненное и опасное состояние, известное как приапизм. Это редкий побочный эффект препаратов для лечения ЭД, но он может возникать, когда они принимаются в развлекательных целях мужчинами, у которых нет проблем с эрекцией.

До сих пор исследования показали, что эти препараты не вызывают риска долгосрочных заболеваний. Но новое исследование, опубликованное в Интернете в JAMA Medicine , демонстрирует связь между употреблением виагры и наиболее опасным видом рака кожи, меланомой.(В исследовании не рассматривались другие аналогичные препараты для лечения ЭД, такие как Сиалис или Левитра, потому что на момент первого сбора данных их не существовало.)

Исследователи проанализировали данные более чем 25 000 мужчин, участвовавших в последующем исследовании медицинских работников . Они обнаружили, что у мужчин, которые принимали силденафил, более известный как Виагра, вероятность развития меланомы в два раза выше, чем у мужчин, которые этого не делали. Это открытие подтвердилось даже после учета известных факторов риска меланомы, включая семейный анамнез рака, воздействие солнца и интенсивность ультрафиолетового излучения в штате, в котором жили мужчины.Связи между самой эректильной дисфункцией и меланомой не было.

Исследователи предупреждают, что их результаты показывают корреляцию, но не доказывают, что Виагра вызывает меланому, и что необходимо провести дополнительные исследования, прежде чем эксперты предложат изменения в рекомендациях по назначению Виагры.

Однако есть научное объяснение тому, как Виагра может увеличить риск меланомы. Виагра относится к классу лекарств, называемых ингибиторами ФДЭ5, в который также входят Сиалис и Левитра.Блокируя фермент PDE5, лекарства помогают гладким мышцам полового члена расслабиться и увеличить кровоток. В своей статье для Everyday Health д-р Адам Фридман объясняет, что ингибирование фермента PDE5, которое также происходит с помощью мутации, обнаруженной во многих опухолях меланомы, увеличивает способность клеток меланомы вторгаться и метастазировать. Он заключает: «Изюминка: возможно, что, ингибируя этот фермент, Виагра может способствовать развитию первичных опухолей меланомы».

Опять же, это не было доказано, и никто не предлагает мужчинам прекратить принимать Виагру из-за этого исследования.Тем не менее, доктор Абрар Куреши, профессор дерматологии в Университете Брауна и соавтор нового исследования, сказал NBC News: «Но люди, которые принимают лекарства и имеют высокий риск развития меланомы, могут подумать о том, чтобы прикоснуться к базе своими руками. поставщик первичной медико-санитарной помощи ».

Facebook — это плохо для вашей самооценки?

Новое исследование, представленное на прошлой неделе на конференции Международной ассоциации связи, предполагает, что Facebook не только тратит время, но и может нанести ущерб самооценке некоторых пользователей.

Исследователи опросили более 800 студенток колледжа, чтобы оценить их привычки в Facebook и их внешний вид. Респондентов спрашивали, как часто они посещают сайт, как долго они обычно там проводят, что смотрят и о чем думают, когда смотрят. Например, был задан один вопрос: «Когда вы смотрите на чужие фотографии в Facebook, сколько внимания вы уделяете: 1) тому, как они одеваются, и 2) их телу?» Затем их спросили, что они думают о собственном теле, в том числе, каков их текущий вес и что они в идеале хотели бы взвесить.Другие вопросы касались привычек в еде и успеваемости в школе.

В среднем респонденты проводили в Facebook 80 минут, читая свою новостную ленту и просматривая фотографии. Их средний вес составлял около 149 фунтов, но большинство респондентов хотели весить на 20 фунтов меньше, чем они на самом деле. Женщины, которые проводили больше времени в Facebook, с большей вероятностью плохо относились к собственному телу и сравнивали себя с другими. Это было особенно актуально для женщин, которые чувствовали, что им нужно похудеть. Женщины, которые хотели набрать или сохранить свой вес, не чувствовали себя плохо после использования Facebook.

Конечно, исследование не доказывает, что Facebook вызывает заниженную самооценку, но оно предполагает, что время, проведенное на сайте, может усугубить проблемы с изображением тела. Петя Эклер, ведущий автор исследования, в интервью HealthDay отметила: «Женщины, как правило, представляют в Facebook свое идеальное« я », не обязательно свое настоящее, истинное« я »».

На данный момент мы все знаем, что фотографии моделей в журналах ретушируются, чтобы они выглядели тоньше, но Эклер говорит, что друзья могут сделать это также с помощью Photoshop или других приложений, таких как Skinneepix, которые специально разработаны для «бритья фунтов». от картинок.Сравнивая себя с этими идеализированными фотографиями друзей, женщины могут почувствовать себя неполноценными. Эклер опасается, что в конечном итоге это может привести к расстройству пищевого поведения. «Негативное отношение к себе и более частое сравнение тела — это своего рода первый шаг к нарушению пищевого поведения», — сказал Эклер.

Это не обязательно означает, что мы все должны выйти из социальной сети. Но мы должны стать более осведомленными потребителями фотографий и помнить, что сравнивать себя с возможно отретушированными фотографиями других людей — даже фотографиями друзей — не совсем справедливо.

исследований по восстановлению дефектной центросомной функции сперматозоидов человека | Репродукция человека

Аннотация

ИСТОРИЯ ВОПРОСА: При оплодотворении человека функция центросомы сперматозоидов важна для движения и слияния пронуклеусов у мужчин и женщин. В этом исследовании мы исследовали возможность восстановления центросомной функции человеческого сперматозоида в сперматозоидах, демонстрирующих нарушения в организации микротрубочек. Методы. Сперма была получена как от фертильного донора, так и от пациента с дисплазией фиброзной оболочки (DFS).После гетерологичной ИКСИ с использованием спермы человека мы исследовали микротрубочки и конфигурацию хроматина в ооцитах крупного рогатого скота. Сперматозоиды обрабатывали дитиотреитолом (DTT) перед ИКСИ, а ооциты обрабатывали стабилизатором цитоскелета паклитакселом после ИКСИ. Результаты. Комбинация DTT и лечения паклитакселом индуцировала организацию микротрубочек в мертвых сперматозоидах от фертильного донора после гетерологичной ИКСИ. Однако это лечение не было эффективным для сперматозоидов DFS. Кроме того, экспрессия центрина, белка, функционирующего в центросоме сперматозоидов, была снижена в сперматозоидах DFS по сравнению с нормальными уровнями, наблюдаемыми в фертильных донорских сперматозоидах.ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Эти результаты показывают, что центросомная функция сперматозоидов может быть индуцирована обработкой сперматозоидов DTT перед ИКСИ и ооцитов паклитакселом после ИКСИ. Сперматозоиды DFS, вероятно, будут демонстрировать такую ​​серьезную дисфункцию центросомы сперматозоидов, которую нельзя компенсировать этим лечением; следовательно, этот метод может быть практическим способом определения степени центросомной дисфункции сперматозоидов.

Введение

ICSI — это инновационный метод лечения мужского бесплодия (Palermo et al., 1992), хотя значительное количество клинических случаев неудач оплодотворения сохраняется даже после ИКСИ (Rawe et al. , 2003). Хотя имеется лишь ограниченная информация о молекулярных и клеточных механизмах оплодотворения после попадания сперматозоидов в цитоплазму ооцита, центросомная функция сперматозоидов имеет решающее значение для оплодотворения человека. После попадания сперматозоидов в цитоплазму ооцита центросома сперматозоидов действует как центр организации микротрубочек (MTOC) для организации излучающих микротрубочек, называемых «звездочками сперматозоидов».Эта организация микротрубочек из центросомы сперматозоидов важна для движения и слияния мужских и женских пронуклеусов (Schatten, 1994; Simerly et al. , 1995). Следовательно, правильное функционирование центросомы сперматозоидов человека считается важным для фертильности человека, хотя прямая оценка центросомной функции человеческого сперматозоида затруднена. Недавно было сообщено о ряде новых методов исследования центросомной функции сперматозоидов с использованием гетерологичной системы ИКСИ, в которой человеческие сперматозоиды вводили микроинъекциями кролику (Terada et al., 2000, 2004) или ооцит крупного рогатого скота (Nakamura et al. , 2001, 2002). Организация микротрубочек в этих системах происходит от отцовской центросомы во время оплодотворения; эти организации микротрубочек подобны тем, которые функционируют при оплодотворении человека. В ооцитах кроликов скорость образования сперматозоидов человека коррелировала со скоростью расщепления, но не отражала скорость образования пронуклеусов при клиническом ЭКО (Terada et al. , 2004). Эти исследования затрагивают тесную взаимосвязь между бесплодием и центросомной дисфункцией сперматозоидов человека.

Дисплазия фиброзной оболочки (ДФС), редкая форма тератозооспермии, приводит к бесплодию. Сперматозоиды DFS, которые неподвижны из-за деформации от середины к хвосту (Chemes et al. , 1987, 1998), также демонстрируют центросомную дисфункцию сперматозоидов; обе эти аномалии могут быть причинами бесплодия (Rawe et al. , 2002). У некоторых пациентов продолжалась неспособность оплодотворения или развития эмбриона даже после выполнения ИКСИ (Chemes and Rawe, 2003).Мы считаем, что существуют искусственные методы восстановления центросомной дисфункции сперматозоидов DFS сперматозоидов.

В этом исследовании мы обрабатывали человеческую сперму, которая продемонстрировала недостаточность центросомной функции, двумя препаратами. Сперма человека имеет дисульфидные связи в головной и перицентриолярной областях (Seligman et al. , 1994; Simerly et al. , 1999; Tateno and Kamiguchi, 1999). Было установлено, что дитиотреитол (DTT), который вызывает уменьшение дисульфидных связей, эффективен для распутывания центросомы сперматозоидов.Паклитаксел (Taxol ™), который действует как стабилизатор цитоскелета, часто используется для изучения динамики цитоскелета (Hewitson et al. , 1997; Mailhes et al. , 1999). Таксол усиливает полимеризацию микротрубочек в цитоплазме ооцита и может восстанавливать скрытую функцию нарушенных центросом сперматозоидов человека. Центрин, вездесущий, чувствительный к кальцию, бипарентский компонент центросом, отделяет аксонемные микротрубочки от связанных с ними базальных тел, потенциально функционируя при дупликации центросом.Аномалии центрина могут привести к неудаче оплодотворения или неполному эмбриональному развитию (Salisbury, 1995; Schiebel and Bornens, 1995; Levy et al. , 1996).

В этом исследовании мы попытались восстановить функцию центросомы сперматозоидов по образованию звездочек, которая не происходит в природе у пациентов с DFS. Мы также исследовали различия в экспрессии центрина между спермой от фертильного донора и пациента с DFS.

Материалы и методы

Все процедуры были выполнены с одобрения внутреннего наблюдательного совета Медицинского факультета Университета Тохоку.

Образцы спермы

сперматозоидов DFS было взято у 36-летнего мужчины, жалующегося на первичное бесплодие, пациента, морфология сперматозоидов и клинический прогресс которого были описаны ранее (Rawe et al. , 2002). Нормальная фертильная сперма была взята у 37-летнего здорового мужчины с детьми.

Гетерологичный ИКСИ со спермой человека в ооцит крупного рогатого скота

Гетерологичный ИКСИ выполняли путем инъекции человеческой спермы в ооциты крупного рогатого скота, как описано ранее (Nakamura et al., 2001). Вкратце, ооциты крупного рогатого скота извлекали из небольших фолликулов и оставляли для созревания в течение 22-24 часов. Цироконсервированные сперматозоиды от пациента со спермой DFS размораживали на водяной бане при 37 ° C. Человеческую сперму от фертильного донора обрабатывали таким же образом для использования в качестве нормального контроля. Центросомную функцию человеческого сперматозоида исследовали на подвижных и мертвых сперматозоидах от фертильного донора и сперматозоидах DFS. Оценка жизнеспособности сперматозоидов фертильного донора проводилась с использованием окрашивания эозином-Y (Всемирная организация здравоохранения, 1999).Сперматозоиды были иммобилизованы коротким пьезоимпульсом. Затем использовали пьезомикроманипулятор (MB-U; PRIM TECH, Япония) для инъекции спермы в ооциты с метафазой II (MII) крупного рогатого скота с удаленными кумулюсными клетками. Затем инъецированные ооциты культивировали в течение 6 часов в среде для разрезания тканей TCM-199 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки в 5% CO ₂ при 38,5 ° C. Все ооциты, которым инъецировали сперму человека, обрабатывали 7% этанолом в TCM-199 через 4 часа после ИКСИ в течение 5 минут, чтобы искусственно вызвать активацию (Horiuchi et al., 2002).

DTT обработка человеческой спермы и обработка таксолом ооцитов крупного рогатого скота после ICSI

И фертильные донорские сперматозоиды, и сперматозоиды DFS обрабатывали в течение 1 ч 5 ммоль / л DTT (Sigma Chemical Co., США) в модифицированной среде HTF (Irvine Scientific Co., США). После промывания в модифицированной HTF с добавлением 10% заменителя сыворотки (SSS) (Irvine Scientific) мы вводили либо мертвую сперму от фертильного донора, либо DFS-сперму в ооциты крупного рогатого скота.Через шесть часов после инъекции часть ооцитов обрабатывали 2 мкмоль / л таксола в TCM-199 в течение 1 часа. Все ооциты фиксировали через 7 часов после ИКСИ. Осмотр проводился при каждой фиксации; эксперимент был повторен три раза.

Иммуноцитохимическое определение микротрубочек и ДНК

Zonae pellucidae удаляли с использованием культуральной среды M2 (Sigma) с добавлением 0,75% протеазы (актиназа E; Kaken Chemical Co., Япония). После 30-минутного периода восстановления ооциты, свободные от зоны, экстрагировали, используя буфер M [25% (об: об) глицерин, 50 ммоль / л KCl, 0.5 ммоль / л MgCl ₂ , 0,1 ммоль / л EDTA, 1 ммоль / л EGTA, 50 ммоль / л гидрохлорид имидазола и 1 ммоль / л 2-меркаптоэтанол, pH 6,8], содержащий 5% (об. / Об.) Метанола и 1% (об. / Об.) Моющего средства Triton X-100 на 15 мин. После фиксации в холодном метаноле в течение 10 минут (Simerly and Schatten, 1993) микротрубочки метили смесью моноклональных антител, специфичных к β-тубулину (клон 2-28-33; Sigma) и ацетилированному α-тубулину (клон 6-11). -B1; Сигма). Первичные антитела выявляли с помощью конъюгированного с флуоресцеином козьего антимышиного IgG (Zymed, США).ДНК детектировали путем мечения с помощью 10 мг / мл Hoechst 33342. После помещения в среду против выцветания (Vectashield; Vector Labs, США) ооциты исследовали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (DMRXA / HC; Leica, Германия). Изображения, полученные с помощью Leica Q550FW (Leica, UK), были записаны в цифровом виде с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc., США). Эти данные использовали для сравнения скорости образования сперматозоидов для каждой группы инъецированных ооцитов с использованием теста χ ² . P <0,01 считались статистически значимыми.

Иммуноцитохимическое определение экспрессии центрина в сперме человека

Образцы плодовитых доноров и спермы DFS, помещенные на покровные стекла, фиксировали с использованием 2% формальдегида в модифицированной HTF в течение 1 часа при 37 ° C. Центрин был обнаружен с помощью поликлональных антител (анти-центрин-1; Sigma). Первичные антитела детектировали с помощью аффинно очищенного козьего антикроличьего иммуноглобулина (целая молекула), конъюгированного с изотиоцианатом тетраметилродамина (TRITC; Sigma). Микротрубочки и ДНК определяли, как описано для фиксированных ооцитов крупного рогатого скота.Образцы спермы на покровных стеклах помещали в среду, препятствующую выцветанию, и исследовали на эпифлуоресцентном микроскопе. В каждом образце было проанализировано всего 1000 сперматозоидов.

Результаты

После оттаивания доля живых сперматозоидов, оставшихся в образцах, составляла 56% от фертильного донора и 36% от пациента с DFS, как было обнаружено окрашиванием эозином-Y. Мы исследовали организацию микротрубочек и конфигурацию хроматина в ооцитах крупного рогатого скота после ИКСИ со спермой человека через 7 часов после ИКСИ (рис. 1).Мы также исследовали образование сперматозоидов, радиального массива микротрубочек, отходящих от центросомы сперматозоидов, после инъекции человеческой спермы в ооциты крупного рогатого скота (Таблица I). Образование сперматозоидов наблюдалось с высокой скоростью (38/46: 82,6%) в ооцитах, инъецированных подвижной спермой от фертильного донора (рис. 1A), но не наблюдалось в большинстве ооцитов, инъецированных спермой DFS (4/42: 9,5%) (Рисунок 1B). Формирование сперматозоидов не наблюдалось в ооцитах, инъецированных мертвой спермой (0/37: 0,0%).Таким образом, мертвые сперматозоиды не могут активировать ооциты крупного рогатого скота; женский пронуклеус не наблюдался после инъекции мертвой спермы (данные не показаны). Однако последующая активация этих ооцитов этанолом может вызвать образование женского пронуклеуса. Однако образования мужских пронуклеусов и организации сперматозоидов не наблюдалось; после инъекции в ооцитах крупного рогатого скота наблюдали только неповрежденную мертвую сперму (рис. 1С). После обработки мертвых сперматозоидов DTT (рис. 1D) наблюдалось образование мужских пронуклеусов; однако образование сперматозоидов не наблюдалось в большинстве этих ооцитов (5/43: 11.6%). Обработка таксолом ооцитов, инъецированных мертвой спермой (рис. 1E), приводила к индукции организации микротрубочек в цитоплазме ооцита крупного рогатого скота; однако организация микротрубочек из центросомы сперматозоидов, называемая «спермой астра», могла наблюдаться только в небольшом количестве этих ооцитов (2/25: 8,0%). Обработка мертвых сперматозоидов DTT до ИКСИ и обработка ооцитов таксолом после ИКСИ может эффективно индуцировать организацию микротрубочек, происходящих из центросомы сперматозоидов (40/57: 70.1%). Ряд организаций микротрубочек также наблюдали из цитоплазмы ооцитов в этих ооцитах (рис. 1F). Напротив, большинство ооцитов, инъецированных спермой DFS, не показывали спермальную звезду, несмотря на предварительную обработку сперматозоидов DTT и обработку ооцитов таксолом после ICSI (3/39: 7,7%) (рис. 1G). В то время как экспрессия центрина спермой наблюдалась в центросоме сперматозоидов почти для всех сперматозоидов от фертильных доноров (989/1000, рис. 1H), экспрессия центрина явно снижалась в сперматозоидах DFS (рис. 1I) до всего 2% (20/1000) от нормальный уровень.

Обсуждение

В 1994 году Schatten (1994) предположил, что колебания кальция во время активации ооцитов вызывают высвобождение хвостовой микротрубочки из базального тела за счет центрин-индуцированного расщепления. Впоследствии центросома сперматозоида фосфорилируется, в то время как дисульфидные связи одновременно восстанавливаются. Центросома сперматозоидов может связывать дополнительный γ-тубулин, полученный из цитоплазмы ооцита, образуя центриоль. Образующийся в результате ореол γ-тубулина образует ядра микротрубочек, которые собираются в сперматозоид (Schatten, 1994).Simerly et al. (1999) сообщил о фосфорилировании центросомы сперматозоидов человека после примирования DTT в бесклеточной системе экстракта.

В случаях некрозооспермии человека ооциты, инъецированные мертвой спермой, не оплодотворяются (Tournaye et al. , 1996). В этом исследовании образование мужских пронуклеусов и центросомная функция сперматозоидов в ооцитах крупного рогатого скота отсутствовали в мертвых человеческих сперматозоидах. В то время как сперма от фертильных доноров активировала ооциты MII крупного рогатого скота с высокой скоростью ∼80% без искусственной активации (Nakamura et al., 2001), мертвые сперматозоиды не могли активировать ооциты MII крупного рогатого скота. Таким образом, искусственная активация введенных ооцитов была достигнута обработкой этанолом. Однако искусственная активация ооцитов не улучшила центросомную функцию сперматозоидов. Обычно восстанавливающая среда ооцита млекопитающих способствует разрыву дисульфидных связей, делая возможной деконденсацию пронуклеусов и, возможно, деконденсацию центросом (Mellon and Rebhun, 1976; Oliver et al. , 1976; Sanders and Salisbury, 1994).DTT-прайминг мертвых сперматозоидов способствовал деконденсации ядра сперматозоидов, но был неэффективен для восстановления недостаточной центросомной функции сперматозоидов. Таким образом, мы попытались восстановить центросомную функцию мертвых сперматозоидов с помощью ускорителя цитоскелета. Обработка только таксолом индуцировала организацию микротрубочек в цитоплазме ооцитов крупного рогатого скота; однако организация микротрубочек центросомой мертвых сперматозоидов не наблюдалась. Затем мы предприняли попытку праймирования сперматозоидов с помощью DTT в сочетании с обработкой таксолом инъецированных ооцитов крупного рогатого скота.Это лечение было эффективным для восстановления центросомной функции мертвых человеческих сперматозоидов. Мы могли наблюдать за спермой, астральным массивом микротрубочек, значительно чаще, чем при других методах лечения. Мы предположили, что DTT вызывает деконденсацию ядра и центросомы сперматозоидов, ускоряя отделение микротрубочек хвоста от базального тела после ИКСИ. После активации ооцита на центросому голого сперматозоида легко воздействует таксол для использования в качестве ускорителя организации микротрубочек.Мертвые сперматозоиды могут иметь некоторые изменения в центросомах, которые затрудняют высвобождение их дисульфидных связей, тем самым влияя на центросомную функцию. Однако представляется вероятным, что эти дефекты не являются серьезными изменениями центросомы сперматозоидов, поскольку эти структуры могут приводить к образованию сперматозоидов после обработки DTT и таксолом. Интересно, что ооциты крупного рогатого скота, обработанные таксолом после ИКСИ, демонстрировали астральную организацию микротрубочек в цитоплазме ооцита. Возможно, что ооциты крупного рогатого скота имеют в своей цитоплазме несколько MTOC, которые могут функционировать в партеногенетическом развитии (Navara et al., 1994). Однако такие структуры не наблюдаются при обычном оплодотворении. Таксол может индуцировать организацию микротрубочек из материнской MTOC, как наблюдали в этом исследовании.

Центросома сперматозоидов DFS не проявляла никакой функции даже после комбинированного лечения DTT и таксолом. В сперматозоидах DFS наблюдается аномальная экспрессия центрина, что указывает на тяжелую центросомную дисфункцию сперматозоидов. Rawe et al. (2002) сообщил об аномальном выравнивании соединения голова-хвост в сперматозоидах DFS, предполагая, что это нарушение является причиной неудач оплодотворения.Комбинация изменений в соединении шея-хвост и аберрантная экспрессия центрина в DFS сперматозоидах может ингибировать высвобождение центросомы сперматозоидов из базального тельца. Если это так, эти сперматозоиды будут демонстрировать тяжелую центросомную дисфункцию, несмотря на лечение DTT спермы и обработку введенных ооцитов таксолом.

В заключение, мы исследовали центросомную функцию сперматозоидов человека с использованием гетерологичной системы ИКСИ в попытке восстановить недостаточную центросомную функцию сперматозоидов путем лечения DTT и таксолом.Хотя необработанные мертвые сперматозоиды демонстрировали центросомную дисфункцию, они хорошо отвечали на лечение DTT перед ИКСИ в сочетании с обработкой ооцитов таксолом после ИКСИ. В сперме пациента с DFS, тератозооспермией, приводящей к бесплодию, наблюдалась центросомная дисфункция и аномальная экспрессия центрина. Обработка DTT и таксолом не была эффективна для восстановления центросомной функции DFS сперматозоидов, что указывает на то, что дефицит сперматозоидов DFS в центросомной функции может быть слишком серьезным, чтобы его можно было спасти с помощью этого метода лечения.Однако гетерологичная система ИКСИ для праймирования сперматозоидов с помощью DTT с последующей обработкой ооцитов таксолом после инъекции сперматозоидов может быть новым методом оценки центросомной функции сперматозоидов. Излишне говорить, что эта система оценки не может быть инструментом для клинического спасения центросомной дисфункции сперматозоидов, потому что в настоящее время мы не можем оценить безопасность этой манипуляции с цитоскелетом.

Рисунок 1.

Конфигурация микротрубочек (зеленый) и хроматина (синий) в ооцитах крупного рогатого скота после ИКСИ с образцами спермы человека ( A — G ).Все ооциты крупного рогатого скота были искусственно активированы 7% этанолом в TCM-199 через 4 часа после ИКСИ и зафиксированы через 7 часов после ИКСИ. MPN = мужской пронуклеус; FPN = женский пронуклеус. ( A ) Ооциты крупного рогатого скота, инъецированные подвижной спермой от фертильного донора без обработки дитиотреитолом (DTT) и / или обработки таксолом, демонстрировали радиальный массив микротрубочек, «звездочку сперматозоидов», организованную из центросомы сперматозоидов. Организация микротрубочек вокруг женского пронуклеуса не наблюдалась. В ооците наблюдали образование как мужских, так и женских пронуклеусов.( B ) В большинстве ооцитов крупного рогатого скота, инъецированных спермой DFS (дисплазия фиброзной оболочки), не было обнаружено никакого образования сперматозоидов или организации микротрубочек в цитоплазме ооцита в отсутствие обработки DTT и / или таксолом. Однако женский пронуклеус и деконденсированное ядро ​​сперматозоидов можно было легко обнаружить. ( C ) Ооциты, инъецированные мертвой спермой от фертильных доноров (мертвые сперматозоиды), не образовывали сперматозоиды, лишенные какой-либо организации микротрубочек в отсутствие обработки DTT и / или таксолом.Введенная сперма осталась нетронутой; в ооците крупного рогатого скота наблюдался только женский пронуклеус. ( D ) Ооциты крупного рогатого скота, инъецированные DTT-обработанной мертвой спермой, демонстрировали образование мужских пронуклеусов; однако в ооците не наблюдали организации микротрубочек из центросомы сперматозоидов. ( E ) После ИКСИ с мертвой спермой обработка таксолом может вызвать организацию микротрубочек в цитоплазме ооцита; однако организация микротрубочек из центросомы сперматозоидов не наблюдалась; головка спермы оставалась уплотненной.( F ) После инъекции мертвой спермы, обработанной DTT, ооциты крупного рогатого скота, обработанные таксолом, демонстрировали образование сперматозоидов с образованием мужских и женских пронуклеусов. Образование микротрубочек также наблюдалось вокруг женского пронуклеуса. ( G ) В ооциты крупного рогатого скота инъецировали DFS-сперму, обработанную DTT, которым вводили таксол после ИКСИ. Образования сперматозоидов не наблюдалось; только незначительное количество организации микротрубочек происходит из цитоплазмы ооцита; Наблюдалось образование как мужских, так и женских пронуклеусов.Небольшое количество ооцитов крупного рогатого скота демонстрировало как образование сперматозоидов, так и организацию микротрубочек вокруг женского пронуклеуса, аналогично тому, что наблюдается в F . Бар = 25 мкм. ( H ) Экспрессия центрина наблюдалась на центросоме сперматозоидов в сперме от фертильных доноров. ( I ) В сперматозоидах DFS экспрессия центрина проявлялась только в ~ 2% образцов спермы. Центрин: красный, стрелка. Бар = 10 мкм.

Рисунок 1.

Конфигурация микротрубочек (зеленый) и хроматина (синий) в ооцитах крупного рогатого скота после ИКСИ с образцами спермы человека ( A — G ).Все ооциты крупного рогатого скота были искусственно активированы 7% этанолом в TCM-199 через 4 часа после ИКСИ и зафиксированы через 7 часов после ИКСИ. MPN = мужской пронуклеус; FPN = женский пронуклеус. ( A ) Ооциты крупного рогатого скота, инъецированные подвижной спермой от фертильного донора без обработки дитиотреитолом (DTT) и / или обработки таксолом, демонстрировали радиальный массив микротрубочек, «звездочку сперматозоидов», организованную из центросомы сперматозоидов. Организация микротрубочек вокруг женского пронуклеуса не наблюдалась. В ооците наблюдали образование как мужских, так и женских пронуклеусов.( B ) В большинстве ооцитов крупного рогатого скота, инъецированных спермой DFS (дисплазия фиброзной оболочки), не было обнаружено никакого образования сперматозоидов или организации микротрубочек в цитоплазме ооцита в отсутствие обработки DTT и / или таксолом. Однако женский пронуклеус и деконденсированное ядро ​​сперматозоидов можно было легко обнаружить. ( C ) Ооциты, инъецированные мертвой спермой от фертильных доноров (мертвые сперматозоиды), не образовывали сперматозоиды, лишенные какой-либо организации микротрубочек в отсутствие обработки DTT и / или таксолом.Введенная сперма осталась нетронутой; в ооците крупного рогатого скота наблюдался только женский пронуклеус. ( D ) Ооциты крупного рогатого скота, инъецированные DTT-обработанной мертвой спермой, демонстрировали образование мужских пронуклеусов; однако в ооците не наблюдали организации микротрубочек из центросомы сперматозоидов. ( E ) После ИКСИ с мертвой спермой обработка таксолом может вызвать организацию микротрубочек в цитоплазме ооцита; однако организация микротрубочек из центросомы сперматозоидов не наблюдалась; головка спермы оставалась уплотненной.( F ) После инъекции мертвой спермы, обработанной DTT, ооциты крупного рогатого скота, обработанные таксолом, демонстрировали образование сперматозоидов с образованием мужских и женских пронуклеусов. Образование микротрубочек также наблюдалось вокруг женского пронуклеуса. ( G ) В ооциты крупного рогатого скота инъецировали DFS-сперму, обработанную DTT, которым вводили таксол после ИКСИ. Образования сперматозоидов не наблюдалось; только незначительное количество организации микротрубочек происходит из цитоплазмы ооцита; Наблюдалось образование как мужских, так и женских пронуклеусов.Небольшое количество ооцитов крупного рогатого скота демонстрировало как образование сперматозоидов, так и организацию микротрубочек вокруг женского пронуклеуса, аналогично тому, что наблюдается в F . Бар = 25 мкм. ( H ) Экспрессия центрина наблюдалась на центросоме сперматозоидов в сперме от фертильных доноров. ( I ) В сперматозоидах DFS экспрессия центрина проявлялась только в ~ 2% образцов спермы. Центрин: красный, стрелка. Бар = 10 мкм.

Образование сперматозоидов человека в яйцах крупного рогатого скота

Образование сперматозоидов человека в 9138 9138 9138 .

Авторы выражают признательность доктору Х. Хоши, доктору Т. Ито и доктору М. Каччи (Исследовательский институт функциональных пептидов, Ямагата, Япония) за предоставленный экспериментальный материал. Мы также благодарны профессору Джеральду Шаттену (Центр развития Питтсбурга) за его полезные комментарии и постоянную поддержку. Это исследование было поддержано грантом на научные исследования Японского общества содействия науке (No.157).

Список литературы

Chemes HE, Brugo S, Zanchetti F, Carrere C и Lavieri JC (

1987

Fertil Steril

48

664

Chemes HE и Rawe VY (

2003

Обновление Hum Reprod

9

405

Chemes HE, Olmedo SB, Carrere C, Oses R, Carizza C, Leisner M и Blaquier J (

1998

Hum Reprod

13

2521

Хьюитсон Л., Хаависто А., Симерли С., Джонс Дж. И Шаттен Г. (

1997

Biol Reprod

57

967

Хориучи Т., Эмута С., Ямаути Ю., Оикава Т., Нумабе Т. и Янагимачи Р. (

2002

Рождение нормальных телят после интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов ооцитов крупного рогатого скота: методологический подход. Териогенология

57

1013

Levy YY, Lai EY, Remillard SP, Heintzelman MB и Fulton C (

1996

Cell Motil Cytoskel

33

298

Mailhes JB, Carabatsos MJ, Young D, London SN, Bell M и Albertini DF (

1999

Mutat Res

423

79

Mellon MG и Rebhun LI (

1976

J Cell Biol

70

226

Nakamura S, Terada Y, Horiuchi T, Emuta C, Murakami T., Yaegashi N и Okamura K (

2001

Biol Reprod

65

1359

Nakamura S, Terada Y, Horiuchi T, Emuta C, Murakami T., Yaegashi N и Okamura K (

2002

Hum Reprod

17

2930

Navara CS, First NL и Schatten G (

1994

Dev Biol

162

29

Оливер Дж. М., Альбертини Д. Ф. и Берлин Р. Д. (

1976

J Cell Biol

71

921

Palermo G, Joris H, Devroey P и Van Steirteghem AC (

1992

Ланцет

340

17

Rawe VY, Terada Y, Nakamura S, Chillik CF, Brugo OS и Chemes HE (

2002

Hum Reprod

17

2344

Rawe VY, Olmedo SB, Nodar FN, Ponzio R и Sutovsky P (

2003

Hum Reprod

18

576

Salisbury JL (

1995

Curr Opin Cell Biol

7

39

Sanders MA и Salisbury JL (

1994

J Cell Biol

124

795

Schatten G (

1994

Dev Biol

165

299

Schiebel E и Bornens M (

1995

Trends Cell Biol

5

197

Селигман Дж., Косовер Н.С., Вайссенберг Р. и Шалги Р. (

1994

J Reprod Fertil

101

435

Simerly C и Schatten G (

1993

Методы Enzymol

225

516

Симерли С., Ву Дж. Дж., Зоран С., Орд Т., Роулинз Р., Джонс Дж., Навара С., Геррити М., Райнхарт Дж., Бинор З. и др.(

1995

Nat Med

1

47

Симерли С., Зоран С.С., Пейн С., Доминко Т., Сутовски П., Навара С.С., Солсбери Л. и Шаттен Г. (

1999

Mol Biol Cell

10

2955

Tateno H и Kamiguchi Y (

1999

Зигота

7

321

Terada Y, Simerly CR, Hewitson L и Schatten G (

2000

Biol Reprod

62

557

Terada Y, Nakamura S, Simerly C, Hewitson L, Murakami T., Yaegashi N, Okamura K и Schatten G (

2004

Mol Reprod Dev

67

360

Tournaye H, Liu J, Nagy Z, Verheyen G, Van Steirteghem A и Devroey P (

1996

Fertil Steril

66

331

Всемирная организация здравоохранения (

1999

Заметки автора

1 Кафедра акушерства и гинекологии, Медицинский факультет Университета Тохоку, 1–1 Сейрё-мати, Аоба-ку, Сендай, Мияги 980-8574, Япония, 2 Центр развития Питтсбурга, Научно-исследовательский институт женщин Маги, отделения акушерства, гинекологии и гинекологии Наук, клеточной биологии и физиологии, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания 15213, США, и отделение акушерства и гинекологии, больница Тохоку Косай, 2-3-11 Кокубун-чжоу, Аоба-ку, Сендай, Мияги 980- 0803, Япония

Гель-электрофорез спермы человека: простой метод оценки качества белка спермы | Базовая и клиническая андрология

Субъекты

Свежие образцы спермы были получены от 245 мужчин, представленных для оценки спермы в отделении вспомогательной репродукции нашей больницы (Медицинский центр Университета Лилля, Лилль, Франция).Все образцы были оценены в отношении (i) обычных параметров (объем спермы, концентрация сперматозоидов, количество сперматозоидов в эякуляте, подвижность и жизнеспособность) в соответствии с рекомендациями ВОЗ [4], и (ii) морфология сперматозоидов в соответствии с модифицированным Дэвидом. классификация [7].

Экстракция белков спермы

Каждый свежий образец спермы готовили для анализа белков, как описано ранее [6]. Семенную плазму, незрелые половые клетки и незрелые клетки удаляли центрифугированием (350 × g, 20 мин при комнатной температуре) через 50% PureSperm (Nidacon, Mölndal, Швеция) / среду FertiCult (FertiPro N.В., Бернем, Бельгия). Осадок спермы промывали один раз путем ресуспендирования в 1 мл трис-буферного солевого раствора (10 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 100 мМ NaCl) и дальнейшего центрифугирования (350 × g, 20 мин при комнатной температуре). Затем осадок сперматозоидов ресуспендировали в 500 мкл буфера для лизиса, содержащего 20 мМ Трис, 2% SDS и 1% смесь нуклеаз (GE Healthcare Life Sciences, Пискатауэй, Нью-Джерси, США). Лизаты обрабатывали ультразвуком на льду (40 Гц, 60 импульсов) и центрифугировали (14000 × g, 20 мин при 4 ° C). Супернатанты собирали, а осадок отбрасывали.Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (BioRad, Геркулес, Калифорния, США), следуя инструкциям производителя набора. Перед анализом лизаты белков хранили при -80 ° C.

Одномерный PAGE

Пятнадцать мкг экстрагированных белков из каждого подготовленного образца сперматозоидов разводили в литий-додецилсульфатном буфере (LDS 2 ×, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Гомогенаты белков кипятили в течение 10 мин, быстро центрифугировали при 500 × g (с использованием настольной центрифуги) и наносили на 4–12% полиакриламидный гель (NuPage® Bis-Tris PreCast 12 wells, Life Technologies).Маркеры молекулярной массы (Novex и Magic Marks, Life Technologies) загружали в первую лунку. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 200 В в течение 1 ч. Полиакриламидные гели окрашивали реагентом кумасси синим (0,1% Blue G250 BioRad, Геркулес, Калифорния, США, 50% этанол ( v / v), 10% уксусная кислота (v / v) и H ₂ 0). Полосы белка визуализировали после обесцвечивания 7% (об. / Об.) Уксусной кислотой и 10% этанолом в H ₂ О. Гели были оцифрованы с помощью сканера Perfection V750 Pro (Epson France, Levallois-Perret, France) и Photoshop. Программа Element 9 (Adobe, Париж, Франция).Чтобы оценить потенциальный эффект от концентрации белка, большие количества общего белка (например, 20, 25 и 30 мкг) из образцов спермы загружали в 4–12% акриламидные гели и окрашивали реагентом кумасси синим. Для подавления семенных протеаз образцы спермы обрабатывали коктейлем ингибиторов протеаз (cOmplete ™, Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Одномерный ПААГ выполняли дважды для каждого независимого образца. Денситометрическую интенсивность полос молекулярной массы от 110 до 80 кДа количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.47c, NIH). Данные были выражены в условных единицах.

Идентификация белка

Белковые полосы, окрашенные кумасси-синим, обрабатывали трипсином и наносили разделение на систему для нано-высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЖХ) U3000 (Dionex-LC-Packings, Саннивейл, Калифорния, США). После стадии предварительного концентрирования (с использованием картриджа C18, 300 мкм, 1 мм) образцы пептидов разделяли на колонке Pepmap C18 (75 мкм, 15 см), применяя градиент ацетонитрил / 0,1% TFA: 0% ацетонитрил в течение 3 дней. мин, от 0 до 15% в течение 7 минут, от 15 до 65% в течение 42 минут, от 65 до 90% в течение 5 минут и, наконец, 90% ацетонитрила в течение 6 минут.Скорость потока была установлена ​​на 300 нл / мин, и фракции автоматически собирались каждые 30 с (всего 110 фракций) на мишени AnchorChip ™ MALDI с использованием сборщика фракций Proteineer ™ FC (Bruker Daltonics, Бремен, Германия). На стадии сбора добавляли два мкл матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (0,3 мг / мл в смеси ацетон: этанол; 0,1% TFA-подкисленная вода, 3: 6: 1 об. об. / Об.). Масс-спектрометрию (МС) и МС / МС измерения проводили в автономном режиме с использованием времяпролетного (TOF) / TOF масс-спектрометра Ultraflex ™ II (Bruker Daltonics).Параметры спектрометра приведены в следующем разделе. Фрагментация пептидов управлялась программным обеспечением Warp LC ™ (Bruker Daltonics) с использованием следующих параметров: отношение сигнал / шум> 15, более трех шагов МС / МС на фракцию, если сигнал МС был доступен, допуск 0,15 Да для пика. слияние и устранение пиков, появившихся более чем в 35% фракций.

Измерения на приборе Ultraflex ™ II TOF / TOF были выполнены в автоматическом режиме (с использованием FlexControl ™ 3.0, Bruker Daltonics) для определения молекулярной массы, в режиме рефлектрона для снятия отпечатков пептидной массы MALDI-TOF (PMF) и в режиме «LIFT» для снятия отпечатков пептидной фрагментации MALDI-TOF / TOF (PFF). Внешняя калибровка в диапазоне масс 1000–3200 выполнялась с использованием [M + H] + моноизотопных ионов брадикинина 1–7, ангиотензина I, ангиотензина II, вещества P, бомбезина и адренокортикотропного гормона (клипы 1-17 и 18-39). , используя стандартный набор для калибровки пептидов (Bruker Daltonics).Вкратце, спектры МС были получены при ускоряющем напряжении 25 кВ, напряжении на отражателе 26,3 кВ и импульсном извлечении ионов 160 нс. Каждый индивидуальный спектр был получен путем накопления данных от 800 лазерных выстрелов. Для анализа LIFT-TOF / TOF MS / MS было выбрано максимум пять ионов-предшественников на образец. Ионы-предшественники были ускорены до 8 кВ и выбраны в синхронизированном ионном затворе. Метастабильные ионы, генерируемые лазерным разложением, были дополнительно ускорены путем приложения 19 кВ в ячейке LIFT, и их массы были измерены в режиме рефлектрона.Списки пиков из спектров МС и МС / МС были созданы с использованием программного обеспечения Flexanalysis ™ 3.3 (Bruker Daltonics). Комбинированный поиск PMF и PFF в базе данных UnitProt 2012_06_database (ProteinScape ™ 2.1, Bruker Daltonics) был выполнен с помощью Mascot 2.3.02 (Matrix Science Ltd., Лондон, Великобритания). Таксономический анализ был ограничен последовательностями человека. Допускались толерантность по массе 75 ppm и 1 отсутствующий сайт расщепления (для PMF) и толерантность MS / MS 0,5 Да и 1 отсутствующий сайт расщепления (для MS / MS). Карбамидометилирование цистеина и окисление остатков метионина считали фиксированной и переменной модификациями соответственно.Релевантность идентичности белков оценивалась в соответствии с оценкой вероятностного поиска по молекулярной массе; порог статистической значимости был установлен на уровне p <0,05.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения SAS (версия 9.3, SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). Количественные данные были представлены в виде медианы [межквартильный размах (IQR)]. Нормальность распределения данных проверяли с помощью теста Шапиро-Уилка. Количественные параметры семенной жидкости сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента.Количественные значения денситометрии гелей сравнивали в тесте Краскела-Уоллиса. Возможные связи между значениями денситометрии и параметрами спермы были проанализированы с использованием теста Спирмена. Порог статистической значимости был установлен на уровне p <0,05.

Создайте фальшивую сперму в Photoshop. Вещь из прошлого?

Так что не секрет, что фотошоп стал крупным игроком в области редактирования любых фотографий. Доминирование было продолжительным, однако средний пользователь, казалось, никогда не понимал сложного программного обеспечения, даже после многих лет «безальтернативности».

Однако с развитием технологий и, в частности, великолепно написанными онлайн-редакторами на базе флэш-памяти, это господство, похоже, рассыпалось на куски. Новые возможности и простота использования определенно взяли верх над тяжелыми и почти излишне сложными (без преимуществ) программами старой школы.

Все началось с простых редакторов, нацеленных на объединение основных функций, таких как сайты вроде https://imgflip.com, http: // makeameme.org / и http://www.yourownavatar.com/, которые стали чрезвычайно успешными и теперь перешли к более сложным (только технически, все еще чрезвычайно простым в использовании), таким как многочисленные онлайн-редакторы и наш собственный Cumshot Editor Pro.

Легко имитировать камшоты с давно просроченным сроком

Вроде так. Сайты, посвященные фальсификации камшотов / взрослых добровольцев, существуют уже 3-5 лет, что в некоторой степени удовлетворяет потребность в этом конкретном мужском голоде (а именно, чтобы увидеть женщин, которых вы знаете, покрытых и тонущих в сперме и членах).Однако полагаться на других людей в подделке некоторых из ваших опубликованных фотографий в формате форума было и до сих пор определенно не идеально. Большинству парней, желающих сфальсифицировать свои фотографии, обычно приходится днями ждать подделки одного качества, и это только в том случае, если им повезет. Также были платные фальсификаторы, которые просили от 5 до 10 долларов за фото-фальшивую фотографию с камшотом, что, учитывая время, которое они тратят на фальсификацию, разумно (но определенно не идеально).

Фальшивый камшот, наконец, в лучшем месте

Однако с созданием Cumshot Editor, а затем Cumshot Editor Pro, подделка камшотов, наконец, стала проще.Мы смогли создать множество важных преимуществ по сравнению с традиционными методами старой школы, оставаясь при этом полностью свободными от недостатков (за исключением необходимости подключения к Интернету на долю секунды для загрузки редактора). Давайте их по очереди:

1) Простая навигация по меню
Если вы просмотрели наше обучающее видео, то уже знаете, что навигация в редакторе более чем интуитивна. Есть несколько основных разделов, каждый из которых связан с определенным редактированием, которое может вам понадобиться, и все! Это экономит ваше время и усилия с самого начала.

2) Готовая отредактированная, легко модифицируемая сперма
Все, что вам нужно сделать, это нанести сперму на фотографии. Вы можете изменить его и перетащить, а что нет, все сделано настолько интуитивно, насколько это возможно. Буквально 10 секунд требуется, чтобы покрыть лицо реалистично выглядящей спермой по своему вкусу.

3) Безграничные и бесшовные слои
Вы никогда не будете беспокоиться о слоях снова. После того, как вы поместите сперму (или пенисы, или что-то еще) и будете довольны тем, как она смешивается, просто нажмите «ОК».Вот и все. Вы готовы разместить намного больше поверх уже созданной фотографии. Очень просто, очень быстро, очень интуитивно… реалистично кончает за секунды.

4) Яркость / контрастность / украшение / изменение размера и т. Д. В один клик.
Когда-нибудь хотелось сделать фото больше или ярче одним нажатием кнопки… чтобы вы могли видеть больше деталей, которые вы не могли увидеть ранее. Эта умная система распознает пиксели, расположенные рядом друг с другом, и сможет быстро осветлить / осветлить фотографию одним нажатием кнопки.Вы хотите ясно видеть язык в этих открытых ртах? Просто нажмите кнопку и наполните рот спермой. Это так просто.

Есть также множество других улучшающих функций, разработанных для легкого улучшения и удвоения качества фото втрое, прежде чем приступить к нему. Реально занимает не более 10-20 секунд. Мы объединили множество полезных профессиональных практик фотошопа и сделали их бесплатно доступными одним нажатием кнопки.

Благодаря всем этим функциям имитация камшота стала такой же простой, как и прежде.Мужчина может быть абсолютно и совершенно не знаком с какой-либо программой для редактирования фотографий и при этом создать отличный фальшивый камшот за секунды. Это действительно было так просто.

Поддельное редактирование камшота Предельное увеличение

У нас был пользователь, набравший более 800 очков репутации на связанном сайте за невероятные 1732 фальшивых фото с камшотом, сделанных всего за один месяц! Тот же пользователь сообщил, что за месяц до этого он сделал всего 127 успешных подделок камшотов в фотошопе.