Как сделать пакет битарда: Недопустимое название — Мракопедия

Содержание

Настоящий битард из палаты мер и весов. >Вы — Бред

>>900151
лет 15 назад утром (часов в 10) в шаббат ебанул горячий стояк и стал активно сифонить в достаточно узком сортире
мать (тогда еще жил с ней) поднимает вой, я вылезаю из койки, нацепляю очки и суюсь туда — ага блять — очки тутже потеют и хуй чо видно, без очков вобщем тоже нихуя не видно ибо диоптрия порядочная, но всеже лучше чем потные линзы
ну хуле делать, беру простынь с койки, на сколько получается забинтовываю дырку, труба близко к стене и за нею хуй просунуть… в это время мать вызванивает управдом, чтобы там гасили в подвале стояк и вызывает сантехника
ну и собственно все — никаких обварился, никаких сварился — однозначно подохший был в говно и падая вывернул нахуй отпай, совершенно согласен с главным сантехником
ну потом звонок в дверь, причем тупо зажав кнопку — думал сантехник, но хуй там — соседка двумя этажами ниже прибежала на меня поорать, кричала что у нее евроремонт и что я ей должен теперь все востанавливать, ну я ей предложил в ответ у меня все востановить, ну и говорю же что мол ебанул стояк — это не моя собственность — так что ниибет
в ответ шикарный вопль: «а ты где был? спал чтоли?»
ну блять да, я спал, а что, я должен был сидеть и смотреть на него? когда же он ебанет чтобы вовремя заткнуть пальцем?
вобщем нахуй ушла
пришел пожже сантехник, прилепил резинку, щепку, прижал все это скрутками из стальки. ..
я охуел, добываю нормальный хомут, спрашиваю мол а такими не бывает?
если бы такие ставил бы, говорит, давно бы без денег остался…
в восресенье этот же стояк ебануть умудрился еще в двух местах в разное время
договорились с этажом выше и этажом ниже, нахуй выкинули эти говнотрубы (кстати должна была быть по проэкту оцинковка, но стояли сраные железные), и ебанули пластиковые стояки (холодный тоже, тупо для пофилактики)
а крикунья эта отказалась — у нее же евроремонт
в результате между ней и соседом подомной в плите досихпор торчит кусок говнотрубы, и когда она сочится — этой пизде прилетает

Тян не нужны/Я титан, аккорды для гитары

Am                 F 
За 20 мне, я небрит и мрачен
C    E                   Am 
Против самок я веду неравный бой
   F 	     C    E
Я одиночества герой
  Am                      F 
В моей квартире бардак и сумрак
C 		                E    Am 
Первозданный срач спасён от женских рук
F 	  C      E
Тян не нужны мой юный друг

   Am
Я титан
   F
Я титан
   C
Я титан
 E                    Am  
За ручку не держался с тян
    F
Я титан
    C  E
Я титан

Am                 F 
Тян надо гнать и над ней насмехаться
C    E                   Am 
Ей никогда не победить хентай и прон
   F 	     C       E
Илита выбирает нофапон
  Am                      F 
Я выше чувств, ебли, отношений
C              E                 
Am
Инстинктов низменных давно разорван круг F C E Преобразился мир вокруг Am Я титан F Я титан C Я титан E Am За ручку не держался с тян F Я титан C E Am Я титан F Я титан C Я титан E Am Не надо ламповых мне тян F Я титан C E Я титан E Встречаем солнечный восход C E Am Я и мой любимый кот F C E На голове пакет Am F На голове пакет F И жизнь как грустнотред C E Am На голове пакет
F
C E И жизнь как грустнотред Am Я титан F Я титан C Я титан E Am За ручку не держался с тян F Я титан C E Am Я титан F Я титан C Я титан E Am Не надо ламповых мне тян F Я титан C E Я титан Am F За 20 мне, я небрит и мрачен C E Am Против самок я веду неравный бой F C E Я одиночества герой

IIchan archives — Картинки-макросы и копипаста

>>3664
אין צורך בדיחה עם dvach, לעזאזל. הנה חבר dvach, לעזאזל. הנה חבר «ה м не шутка к вам с dvach, ад. Здесь ребята еще раз. Это не значит. C Нет lirushechka. Катя! Вы находитесь здесь porvut. Анонимус тысяч из вас, черт! Они все raznesut, ад, и все они zhezheshechku Гаш более чем на час. Он rastopchut всех ваших сайтов, и все коллеги pizdolizov.

Akteha, вы сумасшедший, вы остановке, ада, вы konchay CHSV скрывать мне со склада и забыть! Мы идиот поле Жопу zasunul, ад, и крах его жизни. Еще один из ряда вон выходящий случай, ад, и пригрозил судом каждому, и что он убил его родителей, и его жизнь не более, черт! Вы думаете о своем будущем, оно убивает! Френдо dnyavok ваш полет! Вы не хотите, чтобы один слушать и читать! Ни тот, ни другой! У вас есть блошиный рынок, черт! GHE! GHY! GHY! Грязные, грязные pizdenka, черт!

Это не дух, черт! Вы не звук, huevo! Весь мир смотрит на Собчак, Бритни Спирс, Черт! Музыка, книги, блоги — только в России, черт! Здесь, Россия — Dvach. Существует любовь, даже куклы. Вы удар ада устал!

Бывший агент ад, Саша, ад — это obosrali непосредственно на канал! Это CBER ohuet, ад, который является проституткой, проститутки, в основном канале орошаемых земель на основе Shufutinskogo дерьмо. Zhezheshechka заключается в том, что вы? Pizdets аду на протяжении длительного времени. Вы должны делать, черт? Саша проклятие. Что nahuy тролль? К алкоголю, канал, что ад? Minetchiki дьявола из сука! Onanisty, pidarasy, черт!

Катя … Akteha, чтобы взглянуть на raschlenenku. Посмотрите, сколько убитых, количество крови, черт! И они убили, и они были мертвы. Вы находитесь здесь, и я говорю тебе здесь, чтобы посмотреть, как черт Sky — DVACH! Dvach — не vkontakt. Это не odnoklassnikiru. Вы никогда не dostignesh победы. Поскольку мы знаем, что люди, и мы знаем, что Anonimusa, является одной за каждую звезду вы посылаете nahuy! Один! Pizdolizy все снова, ад, и лежал перед вами стоять в очереди, чтобы ваш рынок.

Сидеть в один голос, за период десяти лет, domashka не uchena. Одна из десяти лет, и как оказывать сопротивление, но и радио, со своей армией pizdolizov, черт, как часть своего потенциала, ад, воздух — не войти не может быть сделано.

vaypaesh вам, что Совет каждый день. Убить вас Анонимус shkolotu и сдать оружие. Вы боитесь отправлять редакторов здесь. Я боялась, десять лет назад, бывший также боятся. Яблочко яблоня осенью, будет не победить! Это будет еще одной победы, черт!

Наполеон потерял Ватерлоо, Берлин, и Гитлер проиграл битву. Dvach потерять. DVACH — могила вашей собственной! Вы понимаете? Май, Akteha, sranaya blyadina, в то время как вы находитесь в Тверской, и вернуться к владельцу, и карманные земли obezzhay Рик и учителя, как писать BBPE.

Есть уже zhezheshechka сказал об этом. Мы вышлем для. С десять миллионов тонн сена и nigrov, будет участвовать trollingom себя со стула! Вы, Akteha, huytsa хорошего о его новой работе, вы понимаете?

Катя (коррупция) в … Вы никогда не сможем добиться победы. Аноны во всем мире, во всех частях мира bitardy, все Dvach, все dobrochan против вас. Dvach не хочет войны, и вы, Анонимус Наша политика ясна и сказал Английский: Существует никаких обязательств по Dvach, перевозящих мусор! Pofapaem лучше вместе raschlenenku.

Найти цель на земле. Большая часть земли и ада. Хотите ли вы, в forchong вступил исключение из ада, в нижней части баллона на медведей? Вперед! Nigrapaki см. в аду? Хотите ли вы, черт? Мусора, неизвестно. На ночь, сообщите нам Анонимус тяжести изменить свой веб-Generated. C. zahlestnet по Дерьмо! Двадцать четыре часа, ад, и ваша жизнь будет Черт! Считаете ли вы, черт! Вы знаете, что закончился Бонапарт? Завершить то, что Гитлер? Все другие?

Вы взяли на себя историческую ошибку, ваши бывшие Вы не ценим. Забудьте о том, что раньше. Ваш Френдо сказал вам: нет Эби и головного мозга, zaglohni! Это не слишком поздно, в 21 июня, сорок лет!

Субкультура бунтарей или сверхлюдей? — Битарды » SFW


Битардство — это мировоззрение(с имеющейся собственной терминологией) и образ жизни. В узком смысле это перенос японского хикикомори на постсоветские реалии. В жизни всегда есть иерархия, разные люди, разные темпераменты, характеры. Помимо пробивных и разговорчивых всегда были и тихие, угрюмые и стеснительные, интроверты, любящие одиночество люди.
Битарды, хикки, сычи(слово вошло в обиход от того что мамка и родственники одного битарда назидали ему: вон Ванька Ерохин уже машину купил, а ты всё сидишь за своим компуктером как сыч) — это люди которые идут наперекор господствующей морали и господствующим порядкам, доблестно отстаивают свою свободу, идут против Системы. Итак, возрастная категория может варьироваться от 16 и до 40 и больше лет. В основном парни, девушек очень мало.

В основе жизненной позиции стоит растрата собственного времени по своему усмотрению, получение удовольствий от жизни, зачастую от простых и подручных вещей в виде компьютера и др. Сидя за компом(на битардском жаргоне пека) в сычевальне(на битардском жаргоне своя комната) преуспевающий на своем поприще сыч играет в игры(на битардском жаргоне игори), скроллит тематические сайты(имиджборды, двач, апачан, сосач, харкач, луркморье и др. Зачастую эти тематические форумы поделены на разделы, типа политота, есть одна тян, бред, реквест и тд), с единомышленниками обсуждает и форсит мемы, копипасты, новости, сёрфит интернеты, смотрит фильмы, сериалы, опционально аниме, читает книги, ну и мастурбирует(победить инстинкт размножения не так то просто). Главное отличие от обычного человека, тоесть от раба системы, предрассудков и общества, в том что хиккан не ставит над собой никаких «должен». Он не должен подражать Ваньке Ерохину

(собирательный образ «успешного» одногодки, у которого развиты социальные(социоблядь на битардском жаргоне) навыки и животная доминантность), отслужить в армии чтобы стать мужиком, заводить себе жируху(жену) с личинками-годовасиками-тугосерями(детьми), обременять себя ипотеками и кредитами например на жоповозку(машину), РАБотать за копейки на ненавистной РАБоте, а то и не на одной и тд. Битардам зачастую неведомы моральные ограничения и сопереживание, тех кто является рабом навязанных моральных устоев и принципов презренно называют моралфаг. Они не сопереживают смертям знаменитых людей, не жалеют съеденную зверушку другой зверушкой, их не волнует вопиющая несправедливость и тд. Так же битарды занимаются троллингом в интернете, но не абы каким, а искуссным. Закидывают в нужные паблики (типа овушляшек, веганов, тоесть ведущихся на троллинг и легко раздражимых шокирующим контентом и тд) или на стену в вконтакте фотографии с расчлененкой, половыми органами, фекалиями, заводят фейковые аккаунты и разводят взрослых дядек на анус с супом(фотографию своей голой задницы с подписью на бумажке) и затем кидают эти фотки всем друзьям этих дядек, занимаются травлей мейнстримовых интернет личностей типа Альберта Акчурина.
Как вы уже поняли, битарды не стыдятся того что сидят на шее у престарелой мамки и бабушки, живут на их пенсию или зарплату. Но бывают и исключения, когда битарды работают грузчиками или на еще какой-то специфической подработке. Как вы видите, они практически полностью противопоставляют себя социуму, чётко отграничивают себя от мира быдла и животного поведения.
В специальных форумах, в тематических разделах типа Есть Одна Тян, хикканы обсуждают неправильное поведение молодых парней(пиздолисы на жаргоне) которые зачастую динамятся девушками(на жаргоне Рыбная Дырка, Рыбная, Ненужная), так же обсуждают то как тянки отдаются альфачам и ерохиным. Битарды исповедуют философию ТНН — Тни(девушки) Не Нужны. Они мечтают о Ламповых Няшах-Стесняшах, ищут их, но на самом деле осознают что таких не существует в природе, и поэтому обличают и клеймят животно-инстинктивное поведение девушек, их меркантильность и жажду доминантной гориллы.

В вопросах религии и смерти битарды зачастую не являются носителями религиозных или иных заблуждений, а с полным осознанием принимают факт своей смертности и несуществования послесмертных миров, Богов, смыслов существования, заложенных извне целей. Так же они стараются быть честными с собой и в других жизненных вопросах.
Хикканы со стойкостью стоиков и самураев, с осознанием жизни Сократа и Омара Хайяма понимают конечность жизни, и поэтому выбирают прожить её так как они хотят, в своеобразное удовольствие.

Зачастую битарды сохраняют строжайшую анонимность и опасаются дианона(открытие их настоящей личности, имени фамилии места проживания и тд), но есть и такие как Анатолий Маркин, звезда Ютуба с 56 тысячами подписчиков, он делает обзоры на различную покупную еду и иногда рассказывает о своей жизни, почему не хочет работать в свои 28 лет, о своей сексуальной жизни, о том как ему живется с матерью в однокомнатной квартире, о любимой музыке и любимых компьютерных играх и тд.
Вот его некоторые видео, внимание, первые два просмотреть можно только непосредственно на ютубе:

——————————————————

«Посмотри на этого человека, анон.
Внимательно рассмотри человека на прилагающейся фотографии. Можешь ли ты представить себе, как этот мужчина плачет и набирает дрожащими пальцами телефон какой-то невнятной бляди, чтобы рассказать о своих чувствах к ней? Можешь представить, что он пропускает в очереди жирную мамашу с выблядком на руках? А то, что он работает пол-года, раздавая листовки, чтобы купить себе iphone? Ты видишь в нем человека, который стесняется сказать родителям, что на свой двадцать четвертый день рождения он хочет выпить с друзьями?
Теперь посмотри на него еще раз. Видишь ли ты на нем стильные брендовые вещи? Может он покрыт вздувшимися мускулами и толстыми венами? Он обладает внешностью киноактера или мужчины-модели?
Позади него стоит дорогой автомобиль?
Посмотри снова на этого мужчину и спроси самого себя, что с ним не так?
Почему в его взгляде железо, в его осанке сталь, а вместо кожи свинец?»(c)

новая жизнь после протестов в Беларуси / вДудь

Большая распродажа на OZON: bit. ly/vdud_ozon
По промокоду OZONA06E30 вы получите 300 баллов на первую покупку при заказе в мобильном приложении Ozon

Aviasales.ru — все тот же поиск дешевых авиабилетов

Слава Комиссаренко kzfaq.info/love/RSW…

Уральский стендап www.youtube.com/c/FreshStandup

Другие комики из выпуска:
Гор Гарьянц gorgaryants
Саша Мокин sasha_mokin94
Иван Емельянов nohypeinhere
Павел Кривец pjkrivec
Андрей Колмачевский andrei.kolm…
Сергей Горох gorohsergei
Макс Заяц maxzajac
Андрей Шумилов andrey_shum
Егор Свирский egorsvirski

0:00 Почему наш герой — снова стендапер?
2:26 Как политика изменила юмор Славы
6:34 Слава дает платные интервью?
8:55 Стендап Дудя
11:31 Продюсеру Славы — 19 лет
14:03 Первый стендапер России
15:43 Комики, которые не хотят переезжать с Урала в Москву
20:41 «Я лишился девственности в 25 лет»
22:35 В детстве Слава упал с 8-го этажа. Как он выжил?
25:53 Комиссаренко — хороший
28:56 Леброн или Джордан?
31:58 Почему Слава ушел с ТНТ?
36:31 Начинать с нуля в 35 в лет — как это?
38:25 Серега — чемпион
41:34 Стереотипы про белорусов
43:19 Одеяло — лучшая роль Славы в КВН
44:52 Корпоративное рабство
48:19 Чык-Чырык — как появился мем про Лукашенко?
50:28 Слава запрещен в Беларуси?
52:48 Звонок ОМОНовцу
55:03 «Родителей уже искали в Беларуси»
57:36 Белорусский стендап в Москве
1:00:43 Про насилие в Беларуси
1:05:04 Как ты теперь относишься к Максу Коржу?
1:09:10 Цензура по-белорусски
1:11:22 Почему Россия поддерживает Лукашенко?
1:13:49 Зачем Славе гражданство РФ?
1:21:35 «Лукашенко — молодец»
1:23:38 Как жить, когда вокруг сажают ни за что?
1:25:26 «Непрощенный» — любимый фильм Славы Комиссаренко
1:29:53 Откуда у Славы столько шуток про отношения?
1:36:15 Про интервью Гарика Мартиросяна
1:39:09 Сколько. Ты. Зарабатываешь
1:43:02 Слава хочет быть продюсером?
1:46:25 Вячеслав Дусмухаметов — главный продюсер России
1:49:39 Зачем тогда Дусмухаметов скопировал КВН?
1:51:44 Что будет с Беларусью дальше?
1:53:58 Славу все обожают. Это давит?
1:57:50 Топ-5 русских комиков
1:59:52 Разучиться шутить или пожать руку Лукашенко?
2:00:12 В чем сила?
2:01:19 КОНКУРС!

Как сделать пакет из бумаги: мастер-класс

Ох, и затянуло меня изготовление коробочек. А что делать? Нам, хэндмейдерам, без коробочек никуда ;), да и Новый год на носу — подарки нуждаются в соответствующем праздничном антураже. И всё же попробую внести некоторое разнообразие, не отходя от решения главной задачи этих дней — подготовки к новогодним торжествам. Сегодня мы с вами будем делать подарочные пакеты из бумаги.


Говоря откровенно, скорее всего эту тему я бы упустила из виду, по крайней мере, до Нового года. До сих пор делать пакеты из бумаги мне не приходилось. И то, что здесь к полнейшей для меня неожиданности появились бумажные пакеты, которые я сама же и сделала, — это всё благодаря вам, дорогие друзья. Ваши вопросы и пожелания побуждают меня повнимательнее осматриваться вокруг и вовремя (насколько в моих силах, конечно) находить решения насущных проблем. К тому же расширение собственных творческих горизонтов — не только полезное, но и крайне интересное занятие. Надеюсь, что результаты моих опытов с бумажными пакетами пригодятся и вам.

Найти ответ на вопрос, как сделать пакет из бумаги, сейчас совсем не сложно. В сети полно фото- и видео мастер-классов на эту тему. Однако, как правило, авторы делают пакеты, что называется «на глаз и от руки», и у них это здорово получается. Но новичкам нередко приходится подолгу набивать руку, прежде чем результат порадует точностью форм и линий.

Мы с вами пойдём немного другим путём и, как обычно, воспользуемся шаблонами. Добавим работы принтеру, чтобы не простаивал 🙂

Давайте посмотрим, как следует применять шаблоны в этом случае, на примере самого маленького бумажного пакета (его размеры: 75×110×20 мм).

Для начала скачайте шаблон для него:

Этот шаблон можно распечатывать как на лицевой, так и на изнаночной стороне бумаги.

Как видите, у меня на рабочем столе, помимо легко узнаваемых инструментов, присутствует распечатанная развёртка пакета, декорированная в программе Adobe Photoshop Elements 10.

Я использовала фотобумагу Lomond плотностью 120 г/м², и должна сказать, для пакетов такого размера этой плотности более, чем достаточно.

Кроме того, поскольку пакет будет с ручками, я приготовила дырокол и 2 куска декоративного шнура.

1. Вырезаем развёртку по контуру, переворачиваем её и проводим по линейке биговочные линии, соединяя оставшиеся вне контура отметки.

К слову, точно такой же способ биговки применим и для чехла от спичечного коробка в случае декорирования его в графическом редакторе (при использовании шаблона №2).

2. Сгибаем бумагу по линиям сгиба.

3. Наклеиваем полоску двустороннего скотча вот так:

И склеиваем края развёртки.

4. Формируем дно пакета:

А теперь с помощью скотча склеиваем его.

5. Заворачиваем верхушку пакета внутрь

и пробиваем дыроколом отверстия для ручек.

6. Вставляем в отверстия шнуры, завязывая на концах узелки.

Для изготовления остальных трёх пакетов я использовала дизайнерскую бумагу, сделанную с помощью салфеточной техники.

У этого пакета ручки вырезаны из бумаги.

Делала я их так:

— вырезала по распечатанному шаблону и пробиговала (здесь видны штриховые линии — это из предварительной версии шаблона),

— наклеила двусторонний скотч на всю площадь полоски,

— загнула края к серединке и приклеила их.

После этого вырезала 2 бумажных полоски шириной 1 см и длиной 7 см, с их помощью приклеила ручки к пакету изнутри.

Шаблон для этого пакета с бумажными ручками (размеры: 90×120×30 мм) можно скачать здесь:

Ручки из декоративного шнура для следующего пакета (с размерами: 90×165×30 мм) крепятся точно таким же образом.

Шаблон для данного пакета здесь:

Пакет с ленточкой также сделан по третьему шаблону, а закрывается он так:

На этой стадии пробиваются отверстия:

Как завязать ленточку, я подсмотрела в этом видео:

 

Успехов вам в подготовке к Новому году!

И до новых встреч в КАРТОНКИНО!

Обнаружение ортологии на основе сходства доменов

Оценка показателей сходства COS и MWM

В следующем разделе разработанные меры сходства, COS и MWM, оцениваются по методу NeighbourhoodCorrelation (NC) [18,19]. Методология NC основана на сравнении последовательностей и, как было показано, обеспечивает лучшие результаты классификации семейств белков по сравнению с измерением сходства на основе доменов [18].

Для оценки используются два вручную отобранных набора данных: набор данных, используемый Song et al.[18] (позже сокращенно SD) и набор данных OrthoBench [20] (OB). Набор данных SD включает 20 семейств белков, тогда как набор данных OB включает 69 семейств. Более подробную информацию о наборе данных можно найти в [18,20]. Все белки без DA удаляются из наборов данных SD и OB, соответственно 5 из 1816 и 57 из 1695, для облегчения интерпретации сравнения между измерениями NC, COS и MWM. Более того, одно из семейств в SD, семейство киназ, намного больше, чем другие семейства, и из-за своего размера может создавать систематическую ошибку [18,19].

В соответствии с предыдущими исследованиями [18,19], набор данных SD анализируется как с семейством киназ (SD + ), так и без него (SD ). Затем показатели оцениваются на обоих наборах данных, и любое потенциальное смещение, вызванное присутствием семейства киназ в SD + , может быть обнаружено путем сравнения с результатами, полученными из SD .

Показатели COS, MWM и NC оцениваются на SD + , SD и наборах данных OB с использованием кривых рабочих характеристик приемника (ROC) и значений площади под кривой (AUC).Кривые ROC и оценки AUC используются для сравнения истинных и ложноположительных показателей (TPR и FPR) показателей сходства COS, MWM и NC. Эти сравнения выполняются с использованием стандартной библиотеки машинного обучения Python scikit-learn [31].

На рисунке показаны кривые ROC для показателей COS и MWM с или без взвешивания, а также оценка NC. При оценке показателей COS, MWM и NC по сравнению с SD (рисунок a) эти три показателя дают аналогичные результаты. Параметры O 1 и O 2 с или без взвешивания также дают сопоставимые результаты.Однако для эквивалентного FPR TPR кривых ROC немного ниже для всех показателей сходства (рисунок b) для SD

+ . Снижение TPR по сравнению с FPR гораздо более выражено для меры NC, чем для мер COS и MWM. Снижение TPR по сравнению с FPR для SD + по сравнению с SD для всех показателей можно объяснить присутствием семейства киназ в SD + , поскольку общие TPR и FPR сильно зависят от TPR и FPR семейства киназ.Подобно набору данных SD , параметры O 1 и O 2 с или без взвешивания не дают разных результатов для набора данных SD + .

Кривые ROC. Кривые ROC разработанных мер COS и MWM, а также метода NC по отношению к набору данных SD (панель a

), набору данных SD + (панель b ) и набору данных OB (панель c ). ). Для каждой панели левые графики соответствуют полным кривым ROC, а правые графики — увеличенному подразделу по оси x . С O S О 1 , С O S O 2 , M Вт M O 1 и M Вт M O 2 оцениваются с взвешиванием ( w ) или без него. Влияние семейства киназ в наборе данных SD + на метод, основанный на сходстве последовательностей (NC), четко видно на панели
b
.

Кривые ROC для мер COS, MWM и NC по отношению к набору данных OB (рисунок c) аналогичны кривым набора данных SD + . В наборе данных OB кривые отношения TPR к FPR для NC-показателя намного ниже, чем для других показателей. В этом наборе данных можно обнаружить немного более высокое отношение TPR по сравнению с FPR для показателей COS и MWM с параметром веса, с более сильной разницей TPR по сравнению с FPR между мерами COS с весом и без него.

Пример, в котором оценки сходства на основе доменов более эффективны при группировании белков одного и того же семейства, чем оценки сходства на основе последовательностей, представлен на рисунке.Сравниваются последовательности двух белков, ENSRNOP00000052209 и ENSRNOP00000052216, принадлежащих к семейству PLUNC из набора данных OB. Белки PLUNC (входящие в состав белков, подобных увеличению бактерицидной проницаемости (BPI)) участвуют в защите от бактерий и хорошо известны своей быстрой эволюцией и низким сходством последовательностей [32]. У меры NC на основе последовательностей возникают трудности с правильным извлечением членов семейства PLUNC из-за их низкого сходства последовательностей. Однако белки семейства PLUNC состоят только из двух доменов (PF01273, PF02886).Белки семейства могут состоять из одного или обоих этих доменов. Белки PLUNC четко классифицируются как члены одного семейства методами COS и MWM с высокими показателями сходства.

(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Точечная диаграмма с визуализацией доменов двух белков, принадлежащих к семейству PLUNC (ENSRNOP00000052209 и ENSRNOP00000052216). Затененные области соответствуют идентичности последовательностей между двумя последовательностями. Хотя они имеют один и тот же DA, сходство их последовательностей очень низкое (20.8%). Выполните программу с иглой из пакета EMBOSS [35]. Точечный график был создан с помощью программного обеспечения DoMosaics [36].

Сравнение различных показателей также выполняется на основе оценок AUC. Показатели AUC рассчитываются на основе TPR и FPR различных показателей. В таблице приведены характеристики показателей COS, MWM и NC для трех различных наборов данных (SD

+ , SD , OB).

Таблица 1

AUC для всех методов по сравнению с SD , SD + и наборы данных акушерства

Метод AUC (SD ) AUC (SD + )
AUC (OB)
NC 0.993 0,844 0,919
С O S O 1 0,979 0,987 0,994
С O S O 2
0,971
0,978 0,992
С O S O 1 w 0,98 0.987 0,996
С O S O 2 w 0,971 0,973 0,996
M Вт M O 1 0,98 0,982 0,996
M Вт M O 2 0,972 0,974 0.996
M Вт M O 1 w 0,98 0,981 0,996
M Вт M O 2 w 0,972 0,969 0,997

Показатели COS и MWM превосходят метод NC для SD + и OB по показателям AUC. Показатели AUC из SD аналогичны для всех протестированных показателей, но немного лучше для NC.Оценка AUC для измерения NC из SD + ниже, чем оценки AUC для измерения COS и MWM, и подтверждают, что классификация NC более чувствительна к присутствию семейства киназ в SD + .

Показатели AUC схожи для различных показателей COS и MWM. Когда COS и MWM сравниваются с одним и тем же порядком и схемой взвешивания, измерения MWM работают лучше с набором данных SD , чем измерения COS. Однако для набора данных SD + можно увидеть противоположное, где показатели COS имеют более высокие показатели AUC, чем показатели MWM.

В наборе данных OB, показатели MWM и COS дают очень похожие оценки AUC, в целом немного выше для показателей MWM.

Модель C O S O 1 и M Вт M O 1 Измерения работают так же или лучше, чем C O S O 2 и M Вт M O 2 измерений для всех наборов данных.Более того, схема взвешивания немного увеличивает производительность измерений COS и MWM в наборе данных OB.

Поскольку COS и MWM дают очень похожие результаты, для выбора одной меры сходства контента домена сравнивается сложность обоих показателей. MWM имеет сложность O ( V 2 E ), где V — количество вершин, а E — количество ребер, в то время как мера COS имеет линейную сложность.Следовательно, вычислительная сложность меры COS ниже, чем у MWM. На основании этих результатов алгоритм COS выбран для этапа предварительной обработки протеинаortho.

Оценка определения ортологии белка

Далее представлено прямое применение меры сходства по содержанию домена к обнаружению ортологии белка с оценкой предсказанных ортологичных групп белков. Протеомы 32 членистоногих были загружены с веб-сайта Ensembl Metazoan, версия 20 (дополнительный файл 1: таблица S1).Протеомы членистоногих представляют собой хороший тестовый пример из-за плотности клады и их аннотационных качеств.

PfamA-27.0 с конвейером аннотации pfam_scan.pl используется для присвоения доменов последовательностям белков. Обнаружение ортологичных белков выполняется на наборе данных членистоногих с использованием программного обеспечения porthoDom и proteinortho.

Оценка качества прогноза ортологии выполняется путем сравнения прогнозов ортологии белка с внешним набором данных, используемым в качестве эталона, OrthoDB (версия 5).Поскольку обнаружение ортологичных белков — нетривиальная задача, разные методологии часто приводят к разным результатам, поэтому сравнения протеинорто и портоДома с внешним эталоном позволяют оценивать методологии строго по их общему поведению.

Предсказанные группы ортологичных белков, продуцируемых протеиномortho и porthoDom (сокращенно PGOP для предсказанной группы ортологичных белков), сравниваются с группами ортологичных белков в наборе данных OrthoDB (сокращенно RGOP для контрольной группы ортологичных белков).

PGOP можно разделить на пять неперекрывающихся категорий, в зависимости от отношения между PGOP и RGOP (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S2). Вот пять категорий:

  • надмножество: PGOP является надмножеством по сравнению с RGOP, если все белки RGOP присутствуют в PGOP, а некоторые из белков PGOP не присутствуют в RGOP.

  • подмножество: PGOP является подмножеством по сравнению с RGOP, если все белки PGOP присутствуют в RGOP, но некоторые другие белки RGOP не находятся в PGOP.

  • идентично: PGOP идентичен RGOP.

  • отсутствует: кластер PGOP отсутствует по сравнению со списком кластеров RGOP, если в RGOP не обнаружены белки кластера PGOP.

  • новое: кластер PGOP является новым по сравнению со списком кластеров RGOP, если кластер PGOP состоит из частей нескольких RGOP.

Оценивается влияние следующих параметров porthoDom на эти категории: ограничение сходства контента домена (0.5, 0.7), порядок подобия контента домена ( O 1, O 2) и сворачивание или не сворачивание повторов доменов. Proteinortho используется с параметрами по умолчанию как в porthoDom, так и в автономной версии. Результаты прогнозов протеинорто и портоДома сравниваются с эталонным набором данных и друг с другом.

Сравнение результатов Proteinortho и porthoDom с эталонным набором данных для порогового значения схожести содержимого домена, равного 0,5, представлено на рисунке; результаты для отсечки схожести содержания домена 0.7 можно найти в Дополнительном файле 1: Рисунок S3. Все комбинации параметров porthoDom четко демонстрируют схожие тенденции в соотношении пяти различных категорий. Этот результат аналогичен анализу ROC и AUC, в котором изменение параметров также мало влияло на результаты и всегда давало хорошие классификационные баллы. Устойчивость оценки, вероятно, является результатом попарной оценки доменов, хранящейся в матрице сходства доменов.

Результаты сравнения porthoDom или proteinortho с базой данных OrthoDB.Для этапа подобия содержимого домена porthoDom используются разные параметры, а для обоих методов используются параметры по умолчанию для proteinortho. К параметрам относятся: порог схожести содержимого домена, равный 0,5, сходство содержимого домена, равное O1, соответствующее сравнению одиночных доменов, или O2, соответствующее сравнению пар доменов, и вариант слияния или отсутствия повторов тандемного домена. Различные параметры мало влияют на porthoDom из-за надежности метода подобия содержимого домена.

Количество кластеров в каждой категории представлено в таблице. Общее количество белковых кластеров по сравнению с эталонным набором данных одинаково для протеинов и porthoDom. Доля кластеров, которые являются подмножествами эталона, эквивалентна для двух методологий. Самая большая разница заключается в количестве идентичных и расширенных групп. Кластеры надмножества имеют тенденцию быть более многочисленными для результатов porthoDom, чем для proteinortho, а количество идентичных кластеров больше для proteinortho, чем для porthoDom.porthoDom создает более высокий процент новых кластеров, чем proteinortho, но также находит меньшее количество отсутствующих кластеров для всех комбинаций параметров porthoDom.

Таблица 2

Число и процент кластеров в различных группах оценки для протеинорто и портоДом

(11,03) 11,13)
Метод Протеинорто PorthoDom PorthoDom PorthoDom PorthoDom
(O1, повторять) (O1, повторить) (O2, без повтора) (O2, повторить)
Суперсет (%) 5442 (26.13) 5311 (28,53) 5274 (28,26) 5172 (27,58) 5161 (27,4)
Подмножество (%) 2639 (12,67) 2104 (11,22) 2171 (11,52)
Идентично (%) 1945 (9,34) 1311 (7,04) 1333 (7,14) 1351 (7,21) 1328 9017 7,05)
Новое (%) 7419 (35,62) 7396 (39.73) 7445 (39,89) 7580 (40,43) 7622 (40,45)
Отсутствует (%) 3383 (16,24) 2545 (13,67) 2543 (13,5179) 2543 (13,5179) 13,56) 2559 (13,58)

Изменение параметров порта лишь незначительно влияет на результаты. Модель C O S O 2 Сходство содержимого домена, используемое в porthoDom, является более строгим, чем C O S O 1 подобие.Небольшое уменьшение доли идентичных, подмножеств и расширенных кластеров с C O S O 2 отражает строгость выбора параметра порядка домена. Все комбинации используемых параметров porthoDom устойчивы к присутствию повторов, и сворачивание повторов не изменяет пропорции кластеров в каждой из категорий классификации.

Идентичные кластеры, надмножества и подмножества являются наиболее важными классами для сравнений между PGOP и RGOP.Эти три класса отражают аналогичные кластеры между прогнозом и эталоном. Интересно, что портоДом и протеинорто дают сопоставимую общую долю этих трех классов.

Прямое сравнение кластеров, вычисленных porthoDom и proteinortho, представлено в Дополнительном файле 1: Рисунок S5 (здесь PGOP относится к классификации porthoDom, а RGOP относится к классификации porteinortho). Сравнение показывает, что большинство кластеров идентичны между прогнозами.Влияние маскирующих повторов можно увидеть по количеству созданных подмножеств. Повторы маскирующего домена увеличивают количество кластеров, обнаруживаемых как porthoDom, так и proteinortho, и уменьшают количество кластеров подмножества.

Наконец, тестируется другое количество начальных кластеров, заданных для алгоритма k-medoids: 10, 100, 500 и 1000, в сочетании с пороговым значением подобия содержимого домена 0,5, параметром порядка домена O 1 и никакого повторного схлопывания. Количество начальных кластеров на основе содержимого домена может сильно повлиять на время выполнения программы и результаты прогнозирования.Если установлено слишком мало кластеров, выигрыш во времени выполнения будет незначительным. Однако, если создается большое количество начальных кластеров, подпространства поиска будут многочисленными, что приведет к уменьшению времени вычислений, но потенциально также и к точности. Дополнительный файл 1: Рисунок S6 сравнивает время и классификацию кластеров, созданных различными параметрами инициализации, с протеином.

Сравнение показывает, что установка начального количества k-medoids от 10 до 1000 уменьшает время выполнения (в 4 раза быстрее).Однако количество идентичных кластеров между porthoDom и proteinortho снижается с 13255 до 11102 ( k = 1000 и k = 10 соответственно, на 2153 кластера меньше). Уменьшение количества идентичных кластеров сопровождается увеличением количества надмножеств, подмножеств, новых и отсутствующих кластеров.

В настоящее время не реализован автоматический метод для установки начального числа k-medoids, но разумное число, кажется, составляет одну двадцатую от числа уникальных компоновок доменов, присутствующих в наборе данных.

Несмотря на различия, возникающие в результате прямого сравнения результатов, сравнения с внешним набором данных дают аналогичные прогнозы. Таким образом, возможности предсказания ортологии портоДома и протеинаорто можно рассматривать как эквивалентные.

Обертка porthoDom разработана так же, как и proteinortho. После создания парного сравнения последовательностей его можно повторно использовать с другими параметрами без повторного вызова полного конвейера. Сравнение времени выполняется на полном проходе конвейера между porthoDom и proteinortho.Однако сначала важно отметить, что porthoDom требует дополнительного шага по сравнению с протеиномortho: назначение домена с помощью сценария аннотации Pfam.

Таблица суммирует время, необходимое для трех различных прогонов протеинорто и портоДома с pfam_scan.pl и без него. Оболочка porthoDom в ее полной версии в 2,5 раза быстрее, чем proteinortho, и в 5,7 раза быстрее без предварительной обработки pfam_scan.pl. После назначения домена время, необходимое для завершения прогона porthoDom, занимает кластеризация белков или белков в подпространствах белков с аналогичным содержанием домена.Вычисление попарного сходства между всеми DA (примерно 24000) и их кластеризация занимает около 20 минут; оставшееся время соответствует обработке данных.

Таблица 3

Время работы в минутах протеинов и porthoDom с и porthoDom без pfam_scan.pl для аннотации домена

Имя Протеинорто PorthoDom PorthoDom
(с pfam_scan.пл) (нет pfam_scan.pl)
Бег 1 1587 627 279
Бег 2 1588 649 272
Среднее значение 1587,6 633 273,3

Сокращение времени вычислений является очевидным следствием замены сравнения белков «все против всех» поиском ортологов в подпространстве.Даже с учетом прогресса в скорости, достигнутого в недавнем пакете HMMER3 [33], программное обеспечение hmmscan, используемое сценарием pfam_scan.pl на этапе обнаружения домена, является узким местом с точки зрения вычислительного времени, требующего около 300 минут для назначения доменов в общей сложности 32 протеома членистоногих на 64-ядерном компьютере. Однако, поскольку аннотации доменов в настоящее время являются очень распространенным анализом в сравнительной геномике, многие протеомы уже имеют предварительно вычисленные аннотации. Таким образом, ожидается, что в большинстве случаев пакет porthoDom обеспечит значительное преимущество во времени.

(PDF) Мини-исследование 05 — Дизайн как инструмент для инноваций

I

IN

NN

NO

O-

-G

GR

RI

IP

PS

G

Gl

lo

ob

ba

al

l

R

Re

ev

vi

ie

f

I

In

nn

no

ov

va

at

ti

io

on

n

I

ll

li

ig

ge

en

nc

ce

e

a

an

nd

d

P

ol

li

ic

cy

y

S

St

tu

ud

di

ie

es

s 9000 R

к

P

Па

перем. №

ov

va

at

ti

io

on

n

I

In

nt

te

ll

110004 110005

110005

110004

en

nc

ce

e

a

an

nd

d

R

Re

es

sp

po

на

нс

si

iv

ve

e

A

An

na

al

ly

ys

000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000

si4 M

Mi

дюйм

ni

i-

-S

St

tu

ud

dy

y:

:

D es

ig

gn

n

Приложение 6 — Доля (%) областей образования «Искусство и ремесла» и

«Архитектура и строительство» в общем объеме высшего образования [1998-2005]

Год

Страна 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

Германия 10,3

12,0

12,6

13,1

12,6

12,4

11,6

10,5

Соединенные Штаты Королевство .. 9,5 11,2

. 10,5

. 10,5

Австрия. 10,0

10,3

10,6

10,8

10,1

9,5 8,8

Португалия. . 8,9. . 8,3 5,6 8,7

Ирландия 4,7 12,4

19,8

10,6

10,6

13,6

11,4

8,4

Финляндия 9,0 8,6 7,9 7,1 7,2 6,7 7,7 8,0

Бельгия. . 8,1 8,2 7,7 7,4 8,5 7,8

Швейцария 10,6

9,1 8,8 6,9.7,5 8,3 7,7

Дания. 5,3 5,6 5,7 6,0 6,7 7,0 7,7

Испания 6,0 6,2 6,8 7,6 7,9 7,4 7,5 7,6

Нидерланды 6,4 7,3 7,6 7,1 7,3 7,4 7,4 7,5

Италия 5,4 5,6 5,7 5,5 7,6 5,8 6,5 7 , 3

Чешская Республика 8,7 7,3 6,4 6,1 6,5 5,9 6,4 7,0

Словацкая Республика. 5,4 4,8 7,8 6,8 6,6 6,2 6,4

Греция. . . . . . 2,2 6,2

Франция. 0,1 4,3 4,4 3,5 3,5 3,5 6,0

Норвегия 3,1 3,8 3,5 3,5.3,5 4,2 5,5

Исландия 1,3 0,2 4,1 5,6 4,7 4,2 4,5 4,9

Швеция 1,3 5,0 5,2 4, 7 4,7 4,7 5,1 4,7

Венгрия 4,9 4,0 2,9 3,2 3,5 2,8 2,9 2,8

Польша 1,0 2,1 1 , 9 1,6 1,8 1,9 2,1 2,4

Корея (Республика

) 8,4 8,3 9,2 11,5

11,2

12,2

11,9

12,1

Австралия 6,7 6,9 7,1 6,9 8,5 8,6 8,9 8,3

Новая Зеландия 6,1 6,3 6,2 6, 3 6,8 7,3 7,1 7,1

Канада 6,2 6,4 6,3.. . 6,2 7,0

США 4,3 4,4 4,6 4,7. 7,2 5,8 5,9

Япония 2,5 2,6 2,6 2,5 2,6 2,6 2,8 2,7

Источник: OECD 2008, Education Scoreboard. Собственные расчеты и презентация

. Знаки точки указывают на то, что расчет невозможен.

В таблице показано разнообразие относительного веса областей высшего образования

, относящихся к навыкам проектирования в различных странах ОЭСР.

невозможно определить глобальный тренд за период; в некоторых странах квалификация

имеет тенденцию к возрастанию важности, тогда как в других она снижается или остается стабильной.В 2005 году он колеблется от примерно 2 процентов в Японии или

Польше до более 10% в Германии и Великобритании. Большинство стран имеют квалификацию от

6% до 8% населения с высшим образованием с дипломом

, связанным с дизайном. В Европе, в абсолютных цифрах, Великобритания намного превосходит

50 000 новых квалифицированных специалистов в год, в то время как во Франции и Италии их

чуть меньше 30 000 ежегодно.

Business Week Рейтинг школ D 2007

22

позволяет уточнить

качества квалификации, предоставляемой различными системами образования.

22

Деловая неделя, 5 октября 2007 г. См. Список в ПРИЛОЖЕНИИ.

Сообщество Steam :: Мастерская Steam

Мастерская Steam всегда была отличным местом для поиска модов, карт и предметов, созданных сообществом для самых разных игр. Начиная с The Elder Scrolls V: Skyrim, Мастерская также является отличным местом для создателей контента сообщества, где они могут зарабатывать деньги, продавая свои лучшие работы.

Мы думаем, что это прекрасная возможность поддержать невероятную творческую работу, проделанную создателями модов в Steam Workshop, и поощрить более качественную работу.Эта новая функция позволяет авторам модов выбирать, размещать ли свои предметы по фиксированной цене, по принципу «плати сколько хочешь» или делать свои предметы доступными бесплатно. Как клиент и поклонник Skyrim, вы можете исследовать как платные, так и бесплатные моды, квесты и предметы.

Вся функция лучше всего описана в полном объекте для прессы, а также на странице с подробными объявлениями и часто задаваемыми вопросами здесь: http://www.steamcommunity.com/workshop/aboutpaidcontent

Наряду с этими новыми опциями, доступными для создателей модов, мы Мы добавили несколько функций, чтобы сделать все максимально простым:

Бесплатно, платно или плати сколько хочешь

С более чем 24 000 бесплатных модов, доступных для Skyrim в Steam Workshop, всегда будет много дел. и исследуйте бесплатно.Теперь вы также можете найти моды с указанной ценой или моды, в которых вы можете выбрать, насколько вы хотите поддержать создателей. Цена зависит от создателей мода.

Попробуйте любой мод, без риска

При покупке чего-либо по-прежнему важно потратить немного времени на изучение любого продукта, который вы собираетесь приобрести. Но если после покупки вы обнаружите, что мод сломан или не работает, как было обещано, вы можете легко получить возмещение за этот мод в течение 24 часов с момента покупки. Ознакомьтесь с полной политикой возврата здесь.

Играйте в Skyrim бесплатно в эти выходные

Если вы новичок в Skyrim и еще не пробовали его, сейчас у вас есть шанс. Игра Skyrim, доступная до 26 апреля, бесплатна. Просто зайдите на страницу магазина Skyrim и нажмите кнопку «Играть», чтобы загрузить и начать играть. Если вы решите сохранить игру, ее также можно будет купить со скидкой 75% от обычной цены!

Изучение нового контента

Чтобы подготовиться к этому объявлению, мы попросили несколько разработчиков модов из сообщества подготовить некоторый контент к выпуску. Обзор платных модов Skyrim

Calling Creators!

Независимо от того, начинаете ли вы или уже являетесь профессиональным художником или разработчиком, теперь вы можете зарабатывать деньги на своих творениях в Мастерской Steam.

Начиная с The Elder Scrolls V: Skyrim, вы можете создавать новые косметические предметы, индивидуальные скины, модные дома, эпические квесты, целые новые города или просто новую шляпу для Лидии. Создав свое творение, вы можете легко установить цену и получать часть от каждой продажи, совершенной через Мастерскую Steam.

Кроме того, в ближайшие недели многие ваши любимые игры Workshop будут поддерживать платный контент. Ознакомьтесь с полным объявлением и FAQ для более подробной информации.

ProteinTools: набор инструментов для анализа белковых структур | Исследование нуклеиновых кислот

Абстракция

Экспериментальное описание и компьютерное предсказание белковых структур становятся все более быстрыми и точными.Однако анализ структур белков часто требует от исследователей использования нескольких программных пакетов или веб-серверов, что усложняет задачу. Чтобы обеспечить давно устоявшийся структурный анализ в современном, простом в использовании интерфейсе, мы внедрили ProteinTools, набор инструментов веб-сервера для анализа структуры белков. На данный момент ProteinTools объединяет четыре приложения, а именно идентификацию гидрофобных кластеров, сетей водородных связей, солевых мостиков и карт контактов. Во всех случаях входные данные представляют собой идентификатор PDB или загруженную структуру, тогда как выходными данными является интерактивный динамический веб-интерфейс.Благодаря модульной природе ProteinTools добавление новых приложений станет простой задачей. Учитывая текущую потребность иметь эти инструменты в едином, быстром и интерпретируемом интерфейсе, мы считаем, что ProteinTools станет важным набором инструментов для более широкого сообщества исследователей белков. Веб-сервер доступен по адресу https://proteintools.uni-bayreuth.de.

Graphical Abstract

ProteinTools предлагает анализ гидрофобных кластеров, водородных связей, солевых мостиков и карт контактов в белковых структурах в удобном современном интерфейсе.

Graphical Abstract

ProteinTools предлагает анализ гидрофобных кластеров, водородных связей, солевых мостиков и карт контактов в белковых структурах в удобном современном интерфейсе.

ВВЕДЕНИЕ

Число депонированных структур в базе данных белков растет с экспоненциальной скоростью, при этом 90% имеющихся сегодня структур депонированы за последние 20 лет. Мало того, что экспериментальные методы предоставляют множество структурных данных быстрее, чем когда-либо прежде, но и вычислительные усилия по прогнозированию структур значительно продвинулись за последнее десятилетие.Особенно многообещающими были недавние методы структурного прогнозирования, основанные на глубоком обучении, такие как DMPfold (1) или AlphaFold (2). Усилия, как в экспериментальной, так и в вычислительной областях, позволили охарактеризовать белковые структуры с беспрецедентной скоростью и детализацией. Поэтому крайне важно, чтобы мы внедрили вычислительные инструменты для анализа этих структур с сопоставимой скоростью и сделали такие инструменты доступными для широкого сообщества.

Трехмерная структура белка важна для его биологической функции, поэтому ее характеристика или точный прогноз имеют жизненно важное значение.Белки складываются в свои нативные структуры во взаимодействии, управляемом различными нековалентными взаимодействиями, такими как водородные связи, силы Ван-дер-Вааль, гидрофобные и ионные взаимодействия. Таким образом, чтобы понять особенности и функции белка на молекулярном уровне, важно охарактеризовать эти взаимодействия. Хотя большинство вычислительных усилий в структурной биологии сосредоточено на реализации инструментов, которые предсказывают структуры белков, было выпущено несколько замечательных инструментов для структурного анализа.

Многие из этих инструментов возникли из-за необходимости понимать взаимодействия в контексте динамики белков (3) и, таким образом, сосредоточены на анализе траекторий молекулярной динамики (МД) или являются расширениями наборов инструментов МД. Следует упомянуть пакеты Gromacs (4) и MDtraj (5), которые позволяют анализировать эволюцию молекулярных взаимодействий во времени в языках командной строки и Python. Другие автономные пакеты сосредоточены на анализе этих взаимодействий. В частности, большое внимание уделяется анализу водородных связей, поскольку они играют важную роль в укладке, структуре и функции белков (6).Доступно множество инструментов для определения и анализа водородных связей. Например, HBPredicT определяет водородные связи между водой, лигандами и белками (7). Программы молекулярной визуализации Chimera (8), PyMOL (9) и VMD (10) предлагают несколько инструментов для определения водородных связей в белках и лигандах. Недавно был разработан алгоритм построения водородных связей в глобальном контексте HBplot (11).

Что касается функции белка, то еще одно свойство, которое интересно охарактеризовать, — это обнаружение и анализ полостей и каналов.Были разработаны такие инструменты, как PASS (12) и PocketPicker (13), которые обнаруживают карманы связывания, и CAVER (14), веб-сервер для визуализации каталитических карманов в белках. Многие другие инструменты ориентированы на оценку солевых мостов, например, веб-сервер ESBRI (15) или SBION (16), программа для вычисления солевых мостов из нескольких файлов структуры.

Несмотря на эти значительные достижения, большинство этих инструментов предлагают анализ отдельных структурных свойств и часто доступны в пакетах программного обеспечения, написанных на разных языках программирования.Поэтому пользователям необходимо загрузить и установить несколько инструментов и ознакомиться с различной документацией. Таким образом, жизненно важно улучшить такие инструменты, чтобы сделать их интуитивно понятными. Особенно ценными являются наборы инструментов, которые объединяют множество интересных инструментов на одном веб-сайте, сокращая время анализа и время обучения пользователей. Насколько нам известно, опубликовано не так много веб-серверов в области белков, которые собирают несколько инструментов на одном сайте, хотя мы ожидаем, что эта тенденция изменится. Мы хотели бы выделить Bioinformatics Toolkit (17) для анализа последовательностей белков: он включает, среди прочего, удаленное обнаружение гомологии, предсказание структуры, выравнивание последовательностей и кластеризацию последовательностей.Инструментарий PlayMolecule (18), с другой стороны, предлагает анализ связывания лиганда, включая такие инструменты, как параметризация лиганда или прогноз сродства связывания. Кроме того, были собраны наборы инструментов для проверки качества моделей, особенно структур рентгеновского излучения и ЯМР (19,20). Другими прошлыми инициативами по реализации наборов инструментов были набор инструментов bPE (21), набор инструментов для инженерии и проектирования белков, и StrucTools, которые содержали несколько инструментов, таких как вычисление графиков Рамачандрана или вычисления поверхностей и объемов.К сожалению, эти последние два примера больше не поддерживаются.

Мотивированные возросшей потребностью в инструментах, которые позволяют быстро и автономно анализировать растущее количество структурных данных, мы разработали ProteinTools (https://proteintools.uni-bayreuth.de), набор инструментов для анализа структур белков. На этом этапе мы добавили четыре приложения: идентификация гидрофобных кластеров, сетей водородных связей, солевых мостиков и карт контактов. Гидрофобные кластеры предотвращают проникновение молекул воды в ядро ​​белка и служат в качестве устойчивых тел в высокоэнергетических частично свернутых состояниях.Предыдущее программное обеспечение и серверы для вычисления гидрофобных кластеров, такие как алгоритм контактов структурных единиц (CSU) (22) и веб-сервер BASIC (23), к сожалению, больше не доступны. С недавним появлением мощных инструментов веб-молекулярной визуализации, отличных от Adobe Flash / Java, таких как веб-приложение Mol * (https://molstar.org/), мы можем вернуть вычисление гидрофобных кластеров сообществу. Сети водородных связей обеспечивают связь между остатками, находящимися далеко друг от друга в структуре белка (6,24).Они помогают стабилизировать белок и играют роль при аллостерии. Несмотря на их относительно простую идентификацию, веб-инструмент, который анализирует и отображает сети водородных связей, все еще отсутствует. Другие часто запрашиваемые исследователями белка инструменты анализа — это вычисление солевых мостиков и контактных карт. Таким образом, мы также включили решения этих проблем в ProteinTools. Чтобы продемонстрировать применение этих четырех инструментов, мы используем домен Di-III_14 в качестве примера, сконструированную IF-3-подобную складку с 74 аминокислотами, которая демонстрирует необычные свойства сворачивания (25,26).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гидрофобные кластеры

Было высказано предположение, что боковые цепи остатков изолейцина (ILE), лейцина (LEU) и валина (VAL) часто образуют гидрофобные или так называемые (ILV) -кластеры, которые препятствуют проникновению молекул воды и служат ядрами стабильности при высоких температурах. -энергетические частично свернутые состояния (23). Были разработаны различные инструменты для анализа гидрофобных кластеров исключительно на основе белковых последовательностей (27), которые недавно стали доступны в виде пакета Python (28).Другая возможность — идентифицировать гидрофобные кластеры непосредственно в структуре белка. Их расчет основан на алгоритме контактов структурных единиц (CSU), который также широко используется для расчета карт контактов (22,29). Хотя алгоритм CSU изначально был выпущен как пакет и веб-сервер, оба, к сожалению, больше не доступны. Совсем недавно алгоритм CSU был применен к частному случаю вычисления контактов между гидрофобными атомами для определения кластеров ILV и был выпущен на веб-сервере BASIC, который также больше не доступен (23).Исходный алгоритм работает следующим образом: два атома A и B считаются находящимися в контакте, если молекула растворителя, помещенная на поверхность сферы A, перекрывается сферой Ван-дер-Ваальса атома B плюс сфера, образованная другой молекулой растворителя (30) . Атомы считаются сферами фиксированного радиуса (31). Если молекула воды проникает в сферы нескольких атомов в любом положении, считается, что контакт принадлежит тому, центр которого находится ближе всего к центру атома A.

На практике ProteinTools принимает каждый тяжелый атом ILE, VAL и LEU. во внимание, а затем восстанавливает координаты их соседних атомов.В случае альтернативных конформаций рассматривается только первое состояние. Эти атомы расположены ближе, чем сумма двух ван-дер-ваальсовых радиусов, каждый из которых увеличивается на радиус молекулы воды (1,4 Å). Следовательно, чтобы два атома углерода считались кандидатами на атомные контакты, они должны находиться в пределах 6,56 Å. ProteinTools разделяет каждую атомную сферу на 610 однородных участков, используя сетку Фибоначчи (32,33). Площадь соответствует 0,0016 части общей площади сферы. Затем алгоритм оценивает, перекрываются ли какие-либо из 610 секций со своими соседями.Если это так, то контакт секции объявляется принадлежащим атому, центр которого находится ближе всего к центру исходной сферы.

Алгоритм следует для всех атомов до тех пор, пока не будет вычислена матрица площадей остатков по отношению к остаткам. По умолчанию ProteinTools определяет, что два остатка находятся в контакте, если их общая площадь перекрытия составляет не менее 10 Å 2 . Смежная матрица преобразуется в граф, где каждый компонент соответствует (гидрофобному) кластеру. Общая площадь кластера вычисляется как сумма составляющих его отдельных остаточных площадей.ProteinTools показывает каждый из вычисленных гидрофобных кластеров другим цветом на интерактивной панели. Свойства каждого кластера сведены в таблицу. Результаты доступны для загрузки в виде сеанса PyMOL (9) и таблицы. Реализация гидрофобных кластеров в ProteinTools основана на пакетах Python SciPy и NumPy.

Сети водородных связей

Сети водородных связей — это сети водородных связей, которые соединяют боковые цепи нескольких остатков в белке.Чтобы вычислить различные сети водородных связей, ProteinTools сначала протонирует заданные пользователем координаты с помощью PROPKA (34) и PDB2PQR (35). Для воспроизводимости мы (повторно) протонируем все PDB и рассматриваем только первую конформацию альтернативных боковых цепей. Следуя алгоритму PDB2PQR, протоны добавляются после оценки значений pKa для каждого остатка при pH 7,0 (34). Кроме того, боковые цепи переворачиваются и поворачиваются для оптимизации локальных сетей водородных связей (35). После протонирования ProteinTools вычисляет все водородные сети в боковых цепях белка, используя алгоритм Бейкера-Хаббарда (36).Мы выбрали отсечки ϑ> 120 ° и d <2,5 Å, где ϑ - угол, определяемый тремя атомами, а d — расстояние между донорным водородом и акцепторным атомом. Серверная часть ProteinTools полагается на пакет MDtraj для некоторых из этих вычислений (5). В этом методе рассматриваются атомы «NH» и «OH» в качестве доноров, а также кислород и азот в качестве акцепторов. После того, как все водородные связи были вычислены, мы рассматриваем любые два остатка как связанные, если можно найти последовательный путь водородных связей между ними.ProteinTools назначает разный цвет каждой сети на интерактивной панели Mol *. Каждая водородная связь отдельно описана в таблице. Таблицы и структуры белков можно загрузить в виде файлов CSV и сеансов PyMOL (9) соответственно.

Солевой мостик и расчеты распределения заряда

Мы определяем сети солевых мостиков, выбирая весь кислый кислород и все основные атомы азота и вычисляя матрицу их расстояний «все против всех». Пары с расстояниями менее 4 Å считаются соляными мостами.Альтернативные расположения сайдчейнов не рассматриваются, во всех случаях сохраняется только первое состояние. ProteinTools отображает каждый кластер солевых мостиков отдельно в интерактивном окне. Это приложение также обеспечивает вычисление параметров κ (каппа) и доли заряженных остатков (FCR), которые в первую очередь изучаются лабораторией Паппу (37). κ — мера степени сегрегации зарядов в последовательности. FCR — это доля заряженных остатков в последовательности. Эти значения можно использовать для прогнозирования компактности белков.ProteinTools вычисляет эти значения с помощью пакета CIDER (38). Белковые структуры с визуализированными солевыми мостиками также можно скачать в виде сеанса PyMOL (9).

Контактные карты

Карты контактов с белками представляют расстояния между всеми парами аминокислотных остатков в виде матрицы. ProteinTools вычисляет карты контактов, вычисляя матрицу расстояний между остатками «все против всех» и выбирает минимальное расстояние между любыми двумя атомами в двух оцениваемых остатках.Необработанные данные отображаются на интерактивной панели, которую можно экспортировать в виде таблицы CSV.

Внедрение протеиновых инструментов

ProteinTools разработан с использованием фреймворка Django Python (версия 3.1.2). Бэкэнд полностью реализован на Python. Интерфейс веб-сайта разработан с использованием JavaScript с использованием фреймворка Bootstrap (версия 4.2). Белки визуализируются с помощью веб-пакета PDBe Molstar (39). Конкретные пакеты Python, используемые в каждом приложении, указаны в приведенных выше разделах.Все приложения требуют кода PDB или определяемой пользователем структуры PDB в качестве ввода и предоставляют интерактивное окно в качестве вывода. Данные могут быть загружены в виде таблиц CSV, а для внешней визуализации предоставляются сеансы PyMOL, когда это необходимо. Интернет предоставляет бесплатный доступ всем пользователям и не требует входа в систему. Документация предоставляется для каждого приложения отдельно на https://proteintools.uni-bayreuth.de.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы демонстрируем четыре приложения ProteinTools на примере белка Di-III_14 (код PDB 2LN3).В 2012 году в исключительной работе Koga et al. (26) были определены правила построения идеализированных белковых структур, и несколько белковых складок, обнаруженных в природе, были разработаны с использованием этих принципов. Белки, сконструированные в этой работе, включали ферредоксин-подобную складку, укладку Россмана 2 × 2 и 3 × 1, P-петлю 2 × 2 и IF3-подобную складку. Один из IF3-подобных дизайнов складок, Di-III_14, был дополнительно проанализирован Робертом Мэтьюзом и его лабораторией (25). Di-III_14 представляет собой белок длиной 74 аминокислоты с четырьмя β-цепями и двумя альфа-спиралями, упакованными на одной стороне β-листа.Порядок β-цепей — 1243, причем 4 антипараллельны другим. Исследователи заметили, что, хотя Di-III_14 разворачивается в виде двух состояний в миллисекундной шкале времени, он остается свернутым на несколько секунд при высоких концентрациях мочевины, что является необычной особенностью среди природных белков. Эксперименты выявили многочисленные высокоэнергетические состояния, которые взаимно преобразуются в медленных временных масштабах, что структурно соответствует образованию больших электростатических сетей и гидрофобных кластеров. Здесь мы используем ProteinTools, чтобы показать вычисление этих свойств.

Di-III_14 содержит большой гидрофобный кластер

Basak et al. выполнил ЯМР-анализ с водородным обменом (HDX) Di-III_14, который показал процесс обмена между конформационными состояниями в медленных временных масштабах и который находится в разительном несоответствии с быстрым процессом разворачивания, обнаруженным при денатурации хлорида гуанидиния (25). Хотя оба процесса, как правило, дают сопоставимые оценки для природных белков, оптимизация стабильности, проводимая в процессе разработки белков, может привести к множественным взаимодействиям, которые стабилизируют плотно упакованную внутреннюю часть, что приводит к сложному поведению, не наблюдаемому в природных белках.Авторы нанесли на структуру сильно защищенные амидные водороды основной цепи (NH) и обнаружили, что они соответствуют большому гидрофобному ядру, окруженному полярными боковыми цепями. Здесь мы вычислили гидрофобные кластеры Di-III_14, чтобы дополнить эти результаты, анализ, который можно просмотреть на https://proteintools.uni-bayreuth.de/clusters/structure/2ln3 (рисунок 1A). Анализ гидрофобных кластеров выявляет один кластер, состоящий из 14 остатков, общей площадью 1654,0 Å 2 .Кластер охватывает остатки через все элементы вторичной структуры, причем большинство аминокислот принадлежит β-цепям. Площадь на остаток составляет 44,7 Å 2 , и всего 37 контактов между остатками. Мы задались вопросом, соответствуют ли эти значения особенно плотно упакованному IF3-подобному белку. Мы сравнили гидрофобные кластеры Di-III_14 с кластерами природных IF3-подобных белков. С этой целью мы загрузили все домены из SCOPe (40), базы данных, которая классифицирует белковые структуры в соответствии с их топологией и эволюционными отношениями.Идентификатор SCOPe для IF3-подобных белков d.68. После извлечения всех белков d.68-кратной длины мы отбросили те, длина последовательности которых превышает 150 аминокислот, что привело к 43 членам, указанным в дополнительной таблице S1. Визуализация этих структур с помощью ProteinTools выявила среднее количество кластеров 2,2 на структуру, причем кластер, расположенный между спиралями и цепями, был самым большим во всех случаях. Средняя площадь этого кластера среди белков составляет 1957,5 Å 2 , что немного больше, чем у Di-III_14 (1654.0 Å 2 ), но в пределах одного стандартного отклонения (± 1078,9 Å 2 ). Среднее число остатков составляет 14,1, что соответствует результатам для Di-III_14. Типичный IF3-подобный белок с тремя кластерами и площадью 1978 Å 2 для наибольшего кластера показан на рисунке 1b для сравнения. В свете этих результатов мы не можем сделать вывод, что гидрофобный кластер Di-III_14 значительно отличается от кластеров в IF3-подобных природных белках.

Рисунок 1.

Рисунок 1.

Сети водородных связей

Basak et al. наблюдал две электростатические сети, одна покрывала поверхности α1 и α2, а другая содержала квартет солевых мостиков, которые связывают две внутренние β-нити, β2 и β4. Чтобы обобщить эти результаты, мы рассчитали сети водородных связей Di-III_14 (https://proteintools.uni-bayreuth.de/bonds/structure/2ln3). ProteinTools вычисляет сети водородных связей между боковыми цепями, глядя на доноры и акцепторы азота и кислорода в пределах 2.5 Å и угол более 120 ° (см. Материалы и методы). Di-III_14 содержит восемь сетей водородных связей (рис. 2). Самый крупный, аналогичный описанию Basak et al. , охватывает β1, β2 и β4 и содержит шесть остатков (сеть водородных связей 4, рис. 2, светло-зеленый). Остатки представляют собой Thr6, Glu30, Glu32, Gln64, Arg69 и Arg71. Еще две сети усиливают взаимодействия внутренних цепей: сеть 5 (синий, Asp34 и Lys67) и сеть 7 (темно-желтый, Asp28 и Ser 75).

Рисунок 2.

Рис. 2.

В нашем анализе мы наблюдаем в общей сложности четыре сети водородных связей в спиралях, три из которых в основном охватывают α2. Сеть 3 (оранжевый цвет) состоит из остатков Glu 45, Glu49 и Lys61 и объединяет α2 и β3. Сходным образом сеть 0 (красный) связывает нити и спирали за счет объединения Ser9 в β1 с Asn11 и Glu14 в α1. Две другие сети соответствуют сети 2 (желтый), полностью содержащейся в α2 (остатки Asp50 и Lys 54), и сети 1 (темно-зеленый), связывающей α1 и α2 через Lys12 и Glu43.

Соляные мостики

Приложение

ProteinTool для солевых мостов позволяет находить сети солевых мостов в белке и вычислять параметры сегрегации заряда (37). Мы рассчитали соляные мостики Di-III_14 по адресу https://proteintools.uni-bayreuth.de/salt/structure/2ln3 (рисунок 3). Di-III_14 имеет шесть сетей соляных мостов. Самый большой из них, солевой мостик 4 (выделен), состоит из многих остатков в сети водородных связей 4: Glu30, Glu32, Arg69 и Arg71, и вместе с солевым мостиком 3 (Lys67 и Asp34) охватывает внутренний β-лист.Солевой мостик 2 связывает элементы β4 и α2 (Lys61, Glu45 и Glu49), тогда как солевой мостик 0 связывает α1 и α2 (Lys12, Glu13, Glu40 и Glu43). Наконец, солевой мостик 1 с остатками Asp50, Lys53 и Lys54 охватывает половину α2. Наши сети согласны с Basak et al. , с некоторыми отличиями, вытекающими из нашего более строгого ограничения расстояния 4 Å между парами остатков.

Рисунок 3.

Рисунок 3.

Basak et al. предположил, что необычно большой состав заряженных боковых цепей отличает механизм сворачивания DI-III_14 от природных белков.Авторы построили график зависимости доли заряженных остатков (FCR) от κ для почти всего протеома термофила Sulfolobus solfataricus и наблюдали, что Di-III_14 появляется в другом регионе, чем остальные белки. ProteinTools также способен вычислять эти параметры, давая FCR 0,35 и κ 0,25, что согласуется с Basak et al. результаты. Мы задались вопросом, распространяются ли эти различия между Di-III_14 и природными белками на другие конструкции в работе Koga et al. (21). С этой целью мы взяли все последовательности белка SCOPe из соответствующих складок в Koga et al. и сравнил их с проектами. Разработанные складки и их идентификаторы SCOPe: Fold-I: Ферредоксиноподобная складка (d.58), Fold-II: Rossmann 2 × 2 (c.2), Fold-III: IF3-подобная складка (d.68). , Складка IV: P-петля 2 × 2 раза (c.37), Fold V: Rossmann 3×1 (c.23). Природные белки, принадлежащие этим складкам, имеют тенденцию иметь значения FCR около 0,25 и значения κ около 0,2, кластеризуясь в аналогичную область в пространстве (дополнительный рисунок S1a).Разработанные белки, однако, имеют тенденцию иметь более высокие значения FCR (FCR ≥ 0,35 в 4/5 случаях) и более низкие значения κ (κ = 0,12–0,14 в 4/5 случаях) и поэтому появляются на периферии (дополнительный рисунок S1b). Этот эффект может быть связан с чрезмерной стабилизацией за счет введения взаимодействий во время процесса дизайна белка для обеспечения стабильного дизайна, но эта гипотеза требует дальнейшего изучения.

Контактные карты

Карты контактов с белками представляют собой расстояние между всеми возможными парами аминокислот и обеспечивают сокращенное представление белковых структур, инвариантное к поворотам и трансляциям.Они широко используются в методах машинного обучения и могут применяться для реконструкции трехмерных структур (41) или для анализа сходства белков (42). Поэтому быстрое вычисление карт контактов полезно для самых разных целей. В качестве примера мы рассчитали карту контактов Di-III_14 (рисунок 4).

Рисунок 4.

Рисунок 4.

ОБСУЖДЕНИЕ

В то время как новые методы и автоматизация процессов революционизируют создание структурных данных белков, существует большая потребность в адаптации инструментов для их анализа.Веб-приложения стали особенно полезными в последние годы: они (i) не требуют установки, (ii) доступны с любого компьютера, подключенного к Интернету, и (iii) освобождают пользователя от изучения конкретных программ. Среди веб-серверов наборы инструментов особенно ценны, поскольку они объединяют несколько приложений, для которых в противном случае потребовались бы различные пакеты или веб-серверы. Эти наборы не только упрощают использование, но и помогают направлять анализ и более полно просматривать белковые структуры и выявлять общие закономерности (43).Руководствуясь этими текущими потребностями, мы внедрили ProteinTools в качестве модульного инструментария для анализа белковых структур. На данный момент мы реализовали четыре столь необходимых инструмента анализа: гидрофобные кластеры, сети водородных связей, солевые мостики и карты контактов. Его выпуск особенно своевременен и полезен для сообщества, учитывая, что, насколько нам известно, в настоящее время нет других веб-серверов для расчета гидрофобных кластеров и сетей водородных связей. Модульный характер инструментария облегчит добавление других приложений в ProteinTools.Мы предполагаем интегрировать приложение для генерации мутантов и оценки их ΔΔG °, а также вычисления полостей в ближайшем будущем. Учитывая текущую потребность в инструментах, которые анализируют растущее число белковых структур и возможности их расширения, мы твердо уверены, что ProteinTools станет незаменимым инструментарием для сообщества исследователей белков.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Веб-сервер доступен по адресу https: // proteintools.uni-bayreuth.de.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим сотрудников лаборатории Höcker и Яна Золлера за их обширные отзывы о веб-сайте.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Европейский исследовательский совет [грант ERC Consolidator 647548 «Protein Lego» и грант h3020-FETopen-RIA 764434 «PReART»]; Volkswagenstiftung [94747]. Финансирование платы за открытый доступ: Немецкий исследовательский фонд (DFG) и Университет Байройта в рамках программы финансирования Open Access Publishing, а также ERC [647548].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Greener

J.G.

,

Кандатил

S.M.

,

Jones

D.T.

Глубокое обучение расширяет покрытие геномов de novo белковым моделированием с помощью итеративно предсказываемых структурных ограничений

.

Nat. Commun.

2019

;

10

:

3977

.2.

Старший

А.W.

,

Evans

R.

,

Jumper

J.

,

Kirkpatrick

J.

,

Sifre

L.

,

Green

T.

,

Qin

,

Жидек

A.

,

Нельсон

AWR

,

Bridgland

A.

et al. .

Улучшенное предсказание структуры белка с использованием возможностей глубокого обучения

.

Природа

.

2020

;

577

:

706

710

. 3.

Lauro

G.

,

Ferruz

N.

,

Fulle

S.

,

Harvey

M.J.

,

Finn

P.W.

,

De Fabritiis

G.

Изменение ранжирования стыковочных поз с использованием молекулярного моделирования и приближенных методов свободной энергии

.

J. Chem. Инф. Модель.

2014

;

54

:

2185

2189

.4.

Lindahl

E.

,

Hess

B.

,

van der Spoel

D.

GROMACS 3.0: Пакет для молекулярного моделирования и анализа траектории

.

J. Mol. Модель.

2001

;

7

:

306

317

. 5.

McGibbon

R.T.

,

Beauchamp

K.A.

,

Харриган

М.П.

,

Кляйн

C.

,

Swails

J.M.

,

Hernández

C.X.

,

Schwantes

C.R.

,

Wang

L.P.

,

Lane

T.J.

,

Панде

В.С.

MDTraj: современная ppen-библиотека для анализа траекторий молекулярной динамики

.

Biophys. J.

2015

;

109

:

1528

1532

.6.

Хаббард

Р.E.

,

Kamran Haider

M.

Водородные связи в белках: роль и сила

.

Энциклопедия наук о жизни

.

2010

;

Чичестер, Великобритания

John Wiley & Sons, Ltd

. 7.

Йесудас

J.P.

,

Sayyed

F.B.

,

Суреш

C.H.

Анализ структурных взаимодействий воды и CH ••• π в комплексах протеазы ВИЧ-1 и PTP1B с использованием инструмента прогнозирования водородных связей, HBPredicT

.

J. Mol. Модель.

2011

;

17

:

401

413

.8.

Петтерсен

E.F.

,

Годдард

T.D.

,

Huang

C.C.

,

Диван

G.S.

,

Greenblatt

D.M.

,

Meng

E.C.

,

Ferrin

T.E.

UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа

.

J. Comput. Chem.

2004

;

25

:

1605

1612

.10.

Хамфри

W.

,

Dalke

A.

,

Schulten

K.

VMD: визуальная молекулярная динамика

.

J. Mol. График.

1996

;

14

:

33

38

. 11.

Бикади

Z.

,

Demko

L.

,

Hazai

E.

Функциональная и структурная характеристика белка на основе анализа его сети водородных связей с помощью графика водородных связей

.

Arch. Biochem. Биофиз.

2007

;

461

:

225

234

.12.

Брэди

Г.П.

,

Stouten

P.F.W.

Быстрое предсказание и визуализация карманов связывания белков с помощью PASS

.

J. Comput. Помощь. Мол. Des.

2000

;

14

:

383

401

.13.

Weisel

M.

,

Proschak

E.

,

Schneider

G.

PocketPicker: анализ сайтов связывания лигандов с дескрипторами формы

.

Chem. Cent. J.

2007

;

1

:

7

.14.

Stourac

J.

,

Vavra

O.

,

Kokkonen

P.

,

Filipovic

J.

,

Pinto

G.

,

Brezovsky

J.

,

Damborsky

J.

,

Bednar

D.

Caver Web 1.0: идентификация туннелей и каналов в белках и анализ транспорта лигандов

.

Nucleic Acids Res.

2019

;

47

:

W414

W422

.15.

Costantini

S.

,

Colonna

G.

,

Facchiano

A.M.

ESBRI: веб-сервер для оценки солевых мостиков в белках

.

Биоинформация

.

2008

;

3

:

137

138

. 16.

Сен Гупта

P.S.

,

Mondal

S.

,

Mondal

B.

,

Ul Islam

R.N.

,

Banerjee

S.

,

Bandyopadhyay

A.K.

SBION: программа для анализа соляных мостиков из файлов нескольких структур

.

Биоинформация

.

2014

;

10

:

164

166

.17.

Zimmermann

L.

,

Stephens

A.

,

Nam

S.Z.

,

Rau

D.

,

Kübler

J.

,

Lozajic

M.

,

Gabler

F.

,

Söding

J.

,

Lupas A.

,

Alva

V.

Полностью переработанный набор инструментов биоинформатики MPI с новым сервером HHpred в его ядре

.

J. Mol. Биол.

2018

;

430

:

2237

2243

. 18.

Martínez-Rosell

G.

,

Giorgino

T.

,

De Fabritiis

G.

PlayMolecule ProteinPrepare: веб-приложение для подготовки белков для моделирования молекулярной динамики

.

J. Chem. Инф. Модель.

2017

;

57

:

1511

1516

. 19.

Хофт

р.W.W.

,

Vriend

G.

,

Sander

C.

,

Abola

E.E.

Ошибки в белковых структурах [3]

.

Природа

.

1996

;

381

:

272

.20.

Davis

I.W.

,

Leaver-Fay

A.

,

Chen

V.B.

,

Блок

J.N.

,

Капрал

G.J.

,

Ван

X.

,

Мюррей

L.W.

,

Арендалл

W.B.

,

Snoeyink

J.

,

Richardson

J.S.

et al. .

MolProbity: всеатомные контакты и проверка структуры белков и нуклеиновых кислот

.

Nucleic Acids Res.

2007

;

35

:

375

383

. 21.

Jerath

G.

,

Hazam

P.K.

,

Рамакришнан

В.

bPE toolkit: набор инструментов для вычислительной инженерии белков

.

Syst. Synth. Биол.

2014

;

8

:

337

341

. 22.

Соболев

V.

,

Сорокин

A.

,

Prilusky

J.

,

Abola

E.E.

,

Edelman

M.

Биоинформатика

.

1999

;

15

:

327

332

. 23.

Kathuria

S.V

,

Chan

Y.H.

,

Nobrega

R.P.

,

Ul

A.

,

Ozen

€.

,

Matthews

C.R.

Кластеры боковых цепей изолейцина, лейцина и валина определяют ядра стабильности в высокоэнергетических состояниях глобулярных белков: детерминанты последовательности структуры и стабильности

.

Protein Sci.

2016

;

25

:

662

675

. 24.

Lechner

H.

,

Ferruz

N.

,

Höcker

B.

Стратегии разработки искусственных ферментов и связующих

.

Curr. Opin. Chem. Биол.

2018

;

47

:

67

76

. 25.

Basak

S.

,

Paul Nobrega

R.

,

Tavella

D.

,

Deveau

LM

,

Koga

N.

,

Tatsumi-Koga

R.

,

Baker

D.

,

000 Massi ,

Роберт Мэтьюз

C.

Сети электростатических и гидрофобных взаимодействий модулируют сложную поверхность свободной энергии сворачивания сконструированного белка βα

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2019

;

116

:

6806

6811

.26.

Koga

N.

,

Tatsumi-Koga

R.

,

Liu

G.

,

Xiao

R.

,

Acton

T.B.

,

Montelione

G.T.

,

Baker

D.

Принципы создания идеальных белковых структур

.

Природа

.

2012

;

491

:

222

227

0,27.

Callebaut

I.

,

Labesse

G.

,

Durand

P.

,

Poupon

A.

,

Canard

L.

,

Chomilier

J.

,

Henrissat

Mornon

JP

Расшифровка информации о последовательности белков с помощью гидрофобного кластерного анализа (HCA): текущее состояние и перспективы

.

Ячейка. Мол. Life Sci.

1997

;

53

:

621

645

.28.

Bitard-Feildel

T.

,

Callebaut

I.

HCAtk и pyHCA: инструментарий и API Python для анализа гидрофобных кластеров последовательностей белков

.

2018

; https://doi.org/10.1101/249995.29.

Соболев

V.

,

Wade

R.C.

,

Vriend

G.

,

Edelman

M.

Молекулярный докинг с использованием комплементарности поверхностей

.

Proteins Struct. Funct. Биоинформа.

1996

;

25

:

120

129

.30.

Соболев

В.

,

Эдельман

М.

Моделирование сайта связывания хинона B в реакционном центре фотосистемы II с использованием представлений о комплементарности и контактной поверхности между атомами

.

Proteins Struct. Funct. Биоинформа.

1995

;

21

:

214

225

.31.

Shannon

R.D.

Пересмотренные эффективные ионные радиусы и систематические исследования межатомных расстояний в галогенидах и халькогенидах

.

Acta Crystallogr. Разд. А

.

1976

;

32

:

751

767

. 32.

Wołek

K.

,

Gómez-Sicilia

À.

,

Cieplak

M.

Определение карт контактов в белках: сочетание структурного и химического подходов

.

J. Chem. Phys.

2015

;

143

:

243105

. 33.

Гонсалес

Б.

Измерение площадей на сфере с помощью решеток Фибоначчи и широты-долготы

.

Math. Geosci.

2010

;

42

:

49

64

. 34.

Olsson

M.H.M.

,

Søndergaard

C.R.

,

Rostkowski

M.

,

Jensen

J.H.

PROPKA3: последовательная обработка внутренних и поверхностных остатков в эмпирических прогнозах p K a

.

J. Chem. Теория вычисл.

2011

;

7

:

525

537

.35.

Долинский

T.J.

,

Nielsen

J.E.

,

McCammon

J.A.

,

Baker

N.A.

PDB2PQR: автоматизированный конвейер для установки электростатических расчетов Пуассона-Больцмана

.

Nucleic Acids Res.

2004

;

32

:

665

667

.36.

Бейкер

E.N.

,

Hubbard

R.E.

Водородная связь в глобулярных белках

.

Прог. Биофиз. Мол. Биол.

1984

;

44

:

97

179

0,37.

Das

R.K.

,

Паппу

Р.В.

На конформации внутренне неупорядоченных белков влияет линейное распределение последовательностей противоположно заряженных остатков

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

.

2013

;

110

:

13392

13397

0,38.

Holehouse

A.S.

,

Das

R.K.

,

Ахад

J.N.

,

Ричардсон

M.O.G.

,

Паппу

Р.В.

CIDER: ресурсы для анализа взаимосвязей последовательности и ансамбля внутренне неупорядоченных белков

.

Biophys. J.

2017

;

112

:

16

21

.39.

Mir

S.

,

Alhroub

Y.

,

Anyango

S.

,

Armstrong

D.R.

,

Berrisford

J.M.

,

Clark

A.R.

,

Conroy

M.J.

,

Dana

J.M.

,

Deshpande

M.

,

Gupta

D.

et al. .

PDBe: к инфраструктуре многоразовой доставки данных в банке данных белков в Европе

.

Nucleic Acids Res.

2018

;

46

:

D486

D492

.40.

Fox

N.K.

,

Бреннер

S.E.

,

Chandonia

J.-M.

SCOPe: структурная классификация белков — расширенная, интеграция данных SCOP и ASTRAL и классификация новых структур

.

Nucleic Acids Res.

2014

;

42

:

D304

D309

.41.

Vassura

M.

,

Margara

L.

,

Di Lena

P.

,

Medri

F.

,

Fariselli

P.

,

Casadio

Реконструкция трехмерных структур по картам контакта белков

.

IEEE / ACM Transactions по вычислительной биологии и биоинформатике

.

2008

;

5

:

357

367

.42.

Холм

Л.

DALI и устойчивость формы белка

.

Protein Sci.

2020

;

29

:

128

140

. 43.

Ferruz

N.

,

Lobos

F.

,

Lemm

D.

,

Toledo-Patino

S.

,

Farías-Rico

J.A.

,

Schmidt

S.

,

Höcker

B.

Идентификация и анализ естественных строительных блоков для дизайна белка на основе фрагментов на основе эволюции

.

J. Mol. Биол.

2020

;

432

:

3898

3914

.

© Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

Интегративный анализ иммунологических данных для изучения активации хронических иммунных Т-клеток у успешно пролеченных пациентов с ВИЧ

Аннотация

Цели

Раскрыть сложные взаимосвязи между цитомегаловирусными и аутоиммунными реакциями, микробной транслокацией и хронической иммунной активацией (ХИА) у успешно пролеченных ВИЧ-инфицированных пациентов и изучить опосредованную роль альфа-интерферона в этих процессах.

Проект

Поперечное исследование, проведенное в когорте ANRS CO3 Aquitaine Cohort, проспективной госпитальной когорте ВИЧ-1-инфицированных пациентов в Юго-Западной Франции.

Методы

Пациенты начали антиретровирусную терапию в период с 2005 по 2008 год и получали устойчивую вирусологическую супрессию в течение как минимум двух лет. CIA определяли по процентному содержанию HLA-DR + / CD38 + среди CD8 + Т-клеток. Интегральный анализ проводился с использованием моделирования структурным уравнением (SEM).

Результаты

Основной анализ был проведен у 57 HLA-A * 0201 положительных пациентов из-за наличия процентного содержания актин-, виментин-, ламин-специфичных CD8 + Т-клеток (тесты с ограничением HLA-A2) для дальнейшей характеристики аутоиммунного ответа. Ответ, индуцированный цитомегаловирусом, оценивали с помощью Quantiferon и pp-65 ELISPOT. SEM выявила прямое влияние реакции, вызванной цитомегаловирусом, на CIA (стандартизированная оценка βstd = 0,56, значение p = 0,0004). Влияние аутоиммунного ответа на CIA было непрямым через путь альфа-интерферона, что оценивалось по уровням экспрессии 5-стимулированных альфа-интерфероном генов ADAR, ISG15, IFIT1, Mx1 и OAS1 (влияние аутоиммунного ответа на альфа-интерферон: βstd = 0.36, p-значение = 0,0401; влияние альфа-интерферона на CIA: βstd = 0,39, p-значение = 0,0044). Прямого влияния аутоиммунного ответа на CIA не наблюдалось (значение p = 0,3169). Транслокация микробов, измеренная с помощью 16SrDNA и sCD14 в плазме, не была связана с CIA. Результаты были согласованы у 142 пациентов, у которых цитомегаловирусные реакции и аутоиммунные реакции были измерены с помощью квантиферона и антиядерных антител соответственно. Все анализы, проведенные у HLA-A * 0201 положительных пациентов и в общей популяции, выявили значительное влияние латентной переменной IFN-α на CIA.

Заключение

Была подтверждена роль цитомегаловирусного ответа на CIA, а также участие альфа-интерферона в CIA. Непрямое влияние аутоиммунного ответа на CIA, выявленное через путь альфа-интерферона, требует дальнейшего исследования для подтверждения потенциальной роли аутоиммунитета в отношении CIA у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Образец цитирования: Picat M-Q, Pellegrin I, Bitard J, Wittkop L, Proust-Lima C, Liquet B, et al. (2017) Интегративный анализ иммунологических данных для изучения активации хронических иммунных Т-клеток у успешно пролеченных пациентов с ВИЧ.PLoS ONE 12 (1): e0169164. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164

Редактор: Каталин Андреа Уилкинсон, Кейптаунский университет, ЮЖНАЯ АФРИКА

Поступила: 18 августа 2016 г .; Одобрена: 13 декабря 2016 г .; Опубликован: 3 января 2017 г.

Авторские права: © 2017 Picat et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана Sidaction [AI20-2-01629], CHU Бордо [2009 AO1063-54] и Институтом исследования вакцин. Когорта ANRS CO3 Aquitaine была поддержана Национальным исследовательским агентством по изучению заболеваний и вирусов гепатита [ANRS, Action Coordonnée no.7, Cohortes].

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Активация иммунной системы является ведущим фактором прогрессирования заболевания, вызванного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) [1, 2]. Сохранение иммунной активации связано как с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), так и с сопутствующими заболеваниями, не связанными со СПИДом [3–6], у пациентов, получающих успешную антиретровирусную терапию с длительным вирусологическим подавлением. Примечательно, что хронический альфа-интерферон I типа (IFN-α) является отличительной чертой хронической активации и сообщается как фактор, влияющий на прогрессирование заболевания при хронических инфекциях [7–9], включая ВИЧ [10–12].Механизмы, управляющие хронической активацией иммунной системы и секрецией интерферона I типа, многофакторны и до конца не изучены [13]. Цитомегаловирус (ЦМВ) и микробная транслокация были предложены в качестве факторов, запускающих стойкую иммунную активацию, связанную с инфекцией ВИЧ-1 [14]. Микробная транслокация и связанные биомаркеры, например Было обнаружено, что sCD14 и циркулирующий липополисахарид плазмы [15-17] участвуют в генерации и поддержании хронической иммунной активации.ЦМВ широко распространен у пациентов с ВИЧ и может чаще реактивироваться [18]. Действительно, ВИЧ нарушает баланс между хозяином и коинфекционными или спящими микробами, ухудшая контроль над этими потенциальными патогенами. У ВИЧ-инфицированных взрослых вероятность субклинических всплесков репликации ЦМВ выше, чем у населения в целом. Реактивация и репликация ЦМВ начинаются из-за прогрессирующей потери иммунной функции и, в частности, из-за потери клеточно-опосредованного иммунитета. Повышенное количество ЦМВ-специфических антител и / или Т-клеток было связано с атеросклерозом [19, 20] и нарушением восстановления Т-лимфоцитов CD4 [18] у ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих КАРТ.В целом эти данные предполагают, что коинфекция ЦМВ может быть драйвером стойкой иммунной активации. Действительно, рандомизированное клиническое испытание валганцикловира на CMV-серопозитивных пациентах, получавших АРТ (n = 30), показало, что как ДНК ЦМВ, так и экспрессия CD38 + HLA DR + на Т-клетках значительно снизились у пациентов, получавших терапию валганцикловиром [21]. Параллельно, аутоиммунная активация иммунной системы также подозревается в качестве движущей силы иммунной активации, но связь обнаруживается менее последовательно [22].Следовательно, увеличение доли аутореактивных Т-клеток было показано Rawson et al [23].

Вклад каждого из этих факторов, потенциально варьирующийся от пациента к пациенту и в течение болезни, недостаточно хорошо описан. Используя одномерные и многовариантные линейные регрессии, мы ранее оценили влияние цитомегаловирусной, микробной транслокации и аутоиммунных иммунных ответов на хроническую активацию иммунной системы у 191 ВИЧ-1-инфицированного пациента с долгосрочным вирусологическим подавлением при комбинированной антиретровирусной терапии в Подисследование ACTHIV в когорте ANRS CO3 Aquitaine [24] (таблица S1 для сводных результатов).Мы сообщили, что иммунный ответ против ЦМВ был независимо связан с более высоким процентом активации CD8 + Т-клеток, как измерено с помощью HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клеток. Напротив, аутоиммунный ответ и микробная транслокация не были связаны с хронической иммунной активацией в скорректированных анализах. Однако эти анализы ограничивали две трудности. Во-первых, каждый процесс можно измерить по нескольким биомаркерам. Например, иммунный ответ на ЦМВ можно измерить с помощью Quantiferon-CMV-, CMV-pp65-ELISPOT- и CMV-pp65-специфической-CD8 + Т-клеточной положительности.Следовательно, каждый многомерный линейный регрессионный анализ, учитывающий только один маркер, не отражает всего процесса. Во-вторых, механизм, приводящий к хронической иммунной активации, сложен, многофакторен и включает промежуточные пути, такие как интерферон I типа. Аутоиммунитет, аутоиммунные заболевания и система интерферона I типа тесно связаны. Например, сигнатура интерферона I типа может быть обнаружена при многих аутоиммунных заболеваниях, включая волчанку, дерматомиозит или диабет I типа. Механизмы, участвующие в секреции интерферона I типа у пациентов, предполагают опосредованную иммунными комплексами активацию эндосомных TLR собственной ДНК [25, 26].У пациентов с хроническим ВИЧ было показано, что перекрестная презентация расщепленного каспазой аутоантигена дендритными клетками способствовала размножению и активации аутореактивных CD8 + Т-клеток против виментина [23]. Подобный механизм был описан у пациентов с системной красной волчанкой, у которых интерферон I типа способствует дифференцировке моноцитов в дендритные клетки, которые способны поглощать апоптотические тела и представлять аутоантигены адаптивной иммунной системе. Напротив, виментин является аутоантигеном, на который нацелен иммунный ответ у пациентов с системной красной волчанкой [27].Параллельно цитомегаловирусная инфекция также может стимулировать продукцию IFN-α типа I через гены, стимулированные интерфероном [28].

Мы исследовали гипотезы о прямых эффектах индуцированных ЦМВ, аутоиммунных иммунных ответов, измеряемых процентным соотношением актин-, виментин-, ламин-специфичных CD8 + Т-клеток и микробной транслокации на хроническую иммунную активацию, а также косвенных эффектов, опосредованных Экспрессия гена IFN-α у успешно пролеченных ВИЧ-инфицированных пациентов. Мы стремились раскрыть сложные взаимосвязи между иммунными ответами, индуцированными ЦМВ, аутоиммунными реакциями, микробной транслокацией и хронической иммунной активацией у этих пациентов, а также изучить опосредованную роль IFN-α в этих процессах.Мы выполнили совершенно новую работу, включая новые данные анализа экспрессии генов, которые не были представлены в предыдущем исследовании. Кроме того, мы реализовали отличный и оригинальный подход, используя интегральный анализ моделирования структурных уравнений [29].

Методы

Население

Исследование ACTHIV [24] представляет собой перекрестное исследование, включенное в когорту ANRS CO3 Aquitaine [30], проспективную госпитальную когорту ВИЧ-1-инфицированных пациентов в Юго-Западной Франции.Пациенты начали антиретровирусную терапию в период с 2005 по 2008 год и получали лечение с устойчивым вирусологическим подавлением (нагрузка РНК ВИЧ-1 ниже предела обнаружения 50 копий / мл) в течение как минимум двух лет. Критериями исключения были две последовательные РНК ВИЧ-1 с концентрацией выше 50 копий / мл, коинфекция вирусом гепатита С или вирусом гепатита В и признаки острой инфекции. Протокол ACTHIV был одобрен Наблюдательным советом Университета Бордо. Все пациенты подписали информированное согласие перед участием в исследовании.

Оценка иммунного ответа

Доступные биомаркеры в исследовании ACTHIV для оценки индуцированных ЦМВ, аутоиммунных иммунных ответов, микробной транслокации, количественного определения экспрессии гена IFN-α и хронической иммунной активации представлены ниже. Методы лабораторных измерений, оцениваемых с помощью проточной цитометрии, описаны в Wittkop et al [24] (подраздел «Материалы и методы», озаглавленный «Лабораторные измерения»).

Иммунный ответ, индуцированный цитомегаловирусом.

ЦМВ-индуцированный иммунный ответ определяли по серопозитивности по ЦМВ и с использованием анализа Quantiferon CMV (Cellestis, Австралия), твердофазного иммуноферментного анализа CMV-pp65 (EliSpot) и HLA-A0201 CMV-pp65-специфичных тетрамеров CD8 +. Серопозитивность по ЦМВ оценивалась путем выявления антител иммуноглобулина G и иммуноглобулина М к поздним антигенам ЦМВ (Dade Behring, Deerfield, IL). Quantiferon — торговая марка компании Cellestis, которая сейчас продается Quiagen. В QuantiFERON-CMV используются три специальные пробирки для забора крови, покрытые пептидами, имитирующими CD8 + -специфические эпитопы белков CMV, а также пробирки с отрицательным и положительным контролем.Стимуляция CD8 + Т-клеток в 1 мл цельной крови пептидами CMV индуцирует продукцию IFN-γ у инфицированных людей. Затем используют ELISA для измерения количества IFN-γ, присутствующего в плазме из каждой из 3 пробирок (отрицательный контроль, антиген CMV и контроль митогена). Устойчивый ответ IFN-γ в пробирке с антигеном CMV указывает на иммунитет к CMV. Никакой поправки на количество CD4 или CD8 или соотношение CD4 / CD8 Т-клеток не существует. Пациенты считались положительными по Quantiferon-CMV, если они получали значение выше 0.2 МЕ / мл INFgamma, как определено производителем.

Аутоиммунный иммунный ответ.

Иммунный ответ против специфических аутоантигенов оценивали с помощью титров антиядерных антител (титры ≥ 1: 250 считались положительными), а у пациентов с положительной реакцией на HLA-A * 0201 — процентным содержанием CD8 + Т-лимфоцитов, положительно окрашенных актином. -, нагруженные виментином, ламинатом тетрамеры HLA-A * 0201.

Микробная транслокация.

Мы измерили уровень бактериальной 16SrDNA в качестве прямого маркера микробной транслокации вместе с уровнем растворимого CD14 (sCD14) в качестве суррогатного маркера, поскольку измерения LPS в плазме дали трудно определяемые и противоречивые значения [24].Уровни sCD14 определяли количественно в разбавленных (1/50) образцах плазмы, протестированных в двух экземплярах, с использованием анализа ELISA (Diaclone, Коннектикут, США). 16SrDNA в плазме измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Вырожденные прямой и обратный праймеры, (8F: 5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3 ‘; 361R: 5′-CGYCCATTGBGBAADATTCC-3′) и зонд TaqMan (338P: 5’-FAM-TACGGGAGGCAGCAGT-BHQ1-3) были синтезированы для 16 компании Eurofins MWG biotech. Стандартная кривая была построена из серийных разведений плазмидной ДНК (pCR2.1 TOPO-16SrDNA), содержащий известные числа копий шаблона.

Количественная оценка стимулированных IFN-α генов: экспрессия генов ADAR, ISG15, IFIT1, Mx1 и OAS1.
Экспрессия гена

IFN-α оценивалась с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR) пяти стимулированных IFN-α генов: ADAR, ISG15, IFIT1, Mx1 и OAS1 [31]. Тотальную РНК экстрагировали из мононуклеарных клеток периферической крови (полученные после приготовления фиколла и хранения с ингибитором протекторной РНКазы (Roche application biosciences), используя набор для выделения High чистой РНК (Roche application biosciences).Контроль качества экстракции РНК измеряли с помощью биоанализатора Agilent 2100 в сочетании с набором Agilent RNA 6000 Nano (качество образца РНК учитывалось, если полученный RIN был> 7). Всего 300 нг РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche application biosciences). ПЦР выполняли (RT2 SYBR Green qPCR MasterMix, SA Biosciences) в 96-луночных планшетах с использованием LightCycler 480 (Roche Diagnostics) для определения уровней экспрессии генов-мишеней ADAR, ISG15, IFIT1, Mx1 и OAS1.Измерения экспрессии гена IFN-α выражали как кратное изменение, которое рассчитывали как отношение средних значений значений контрольного и тестового образцов.

Хроническая активация иммунных Т-клеток (результат).

Активация Т-клеток, особенно CD8 + Т-клеток, является признаком хронической ВИЧ-инфекции. Уровни CD38 + на CD8 + клетках повышаются при хронической ВИЧ-инфекции и сильно коррелируют с плазменной виремией [32]. Экспрессия CD38 + обнаруживается на наивных Т-клетках, а также на активированных Т-клетках, тогда как экспрессия молекулы HLA-DR на CD8 + Т-клетках строго отражает активацию Т-клеток.Таким образом, экспрессия маркеров активации, включая CD38 и / или HLA-DR, обычно отслеживается и ассимилируется до степени системной иммунной активации. Следует отметить, что у пациентов с системной красной волчанкой экспрессия маркера HLA-DR на CD8 + Т-лимфоцитах коррелирует с активностью заболевания [33]. Наша цель состояла в том, чтобы охарактеризовать аутоиммунный ответ при хроническом ВИЧ, поэтому мы выбрали коэкспрессию CD38 / HLA-DR на CD8 + Т-клетках в качестве результата для оценки хронической активации иммунных Т-клеток. Процент HLA-DR + CD38 + CD8 + Т-клеток среди подмножества CD8 + Т-клеток оценивали в образцах крови с помощью проточной цитометрии.

Статистический метод и назначение модели

Модели структурных уравнений.

Моделирование структурным уравнением со скрытыми переменными применялось для выполнения интегративного анализа доступных биомаркеров в исследовании ACTHIV. Модели структурных уравнений представляют собой обобщения моделей линейной регрессии, допускающие погрешность измерения как в объясняющих, так и в зависимых переменных. Модели состоят из анализов, которые позволяют производить прямые и косвенные эффекты между переменными.Центральный вопрос исследования часто связан с величинами (т.е. «скрытыми переменными»), которые являются ненаблюдаемыми переменными, для которых не существует прямых измерений. Существование этих «скрытых переменных» может быть обнаружено ассоциациями между измеряемыми переменными [34]. Скрытые переменные отражают тот факт, что несколько наблюдаемых переменных могут быть несовершенными измерениями единой лежащей в основе концепции [35, 36].

Система моделей структурных уравнений обычно разбивается на две подмодели: модель измерения и структурную модель [29].Во-первых, модель измерения определяет построение скрытых переменных с соответствующими наблюдаемыми измеряемыми переменными (называемыми «индикаторами»), которые, как предполагается, коррелируют со скрытой переменной. Проще говоря, индикаторы — это количественные переменные, которые, как предполагается, имеют нормальное распределение, а модель скрытых переменных состоит из системы моделей линейной регрессии индикаторов. В этом исследовании латентные переменные были построены только с количественными биомаркерами. Во-вторых, структурная модель определяет паттерн, посредством которого скрытые переменные и наблюдаемые переменные влияют друг на друга, прямо или косвенно.

Модель с исходной гипотезой.

На основе литературных источников мы выдвинули гипотезу о прямых эффектах CMV-индуцированных, аутоиммунных иммунных ответов и микробной транслокации на хроническую иммунную активацию, а также косвенные эффекты (опосредованную роль) этих факторов через экспрессию гена IFN-α. Основной интегративный анализ был проведен у HLA-A * 0201-положительных пациентов, потому что биомаркеры (тетрамеры), более специфичные, чем титры антиядерных антител при хроническом ВИЧ [23] для характеристики аутоиммунно-индуцированного иммунного ответа, были доступны у HLA-A * 0201-положительных пациентов. только пациенты.

Мы рассмотрели четыре скрытых переменных, которые предположительно связаны с хронической активацией иммунной системы:

  • ЦМВ-индуцированная латентная переменная иммунного ответа, измеренная с помощью Quantiferon-CMV, CMV-pp65-ELISPOT и CMV-pp-65-специфичных-CD8 + Т-клеток (поскольку латентные переменные были построены только с количественными биомаркерами, серопозитивность по ЦМВ не рассматривалась для оценки латентной переменной иммунного ответа, индуцированного ЦМВ),
  • латентная переменная аутоиммунного иммунного ответа, измеренная титрами антиядерных антител и процентным соотношением CD8 + Т-клеток, позитивно окрашиваемых тетрамерами HLA-A0201, нагруженными пептидами из актин-, виментин-, ламин-аутоантигенов,
  • латентная переменная микробной транслокации, измеренная с помощью 16SrDNA и sCD14 в плазме,
  • Скрытая переменная IFN-α, измеренная по уровням экспрессии 5 стимулированных IFN-α генов.Исходная гипотетическая модель представлена ​​на рис. 1 (гипотетические отношения между переменными, идентифицированными априори).

Рис. 1. Первоначально предполагаемая модель, представляющая эффекты индуцированных цитомегаловирусом, аутоиммунных иммунных ответов и микробной транслокации на хроническую иммунную активацию (модель скорректирована с учетом возраста, количества CD4 + Т-клеток и количества регуляторных Т-клеток).

Исследование ACTHIV . Ящики : наблюдаемых переменных; эллипсы : скрытые переменные; ε : ошибки измерения .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164.g001

Статистический анализ

Качественные переменные были описаны как числа (проценты), а количественные переменные как медианы (первый квартиль; третий квартиль) с использованием SAS 9.13 / SAS 9.3 (Институт SAS, Кэри, Северная Каролина, США).

Предварительная обработка данных.

Переменная ответа, то есть процент HLA-DR + / CD38 + среди CD8 + Т-клеток, была log 10 трансформированных. Измерения экспрессии гена IFN-α были нормализованы к трем эталонным генам GADPH, RPL13A, HPRT1 (гены домашнего хозяйства) с использованием метода 2 -ΔΔCT для корректировки данных экспрессии для различий между образцами [37].

Проверка правильности исходной модели.

Целью анализа моделирования структурным уравнением было определить, была ли наша гипотетическая теоретическая модель (рис. 1), основанная на соответствующей литературе, подтверждена нашими выборочными данными, чтобы отразить эту теорию. Согласованность оценивалась с помощью соответствия модели и данных, что указывало на степень правдоподобности постулируемой сети отношений между переменными.

Модели структурных уравнений были построены с использованием данных от субъектов без пропущенных данных для переменных, включенных в модель (полный анализ случая).Модели структурных уравнений были выполнены с помощью статистического программного обеспечения R с использованием пакета Lava для линейных моделей со скрытыми переменными [38]. Параметры получены методом максимального правдоподобия. Мы начали моделирование с изначально предполагаемой модели (рис. 1). Незначительные пути были исключены, чтобы оптимизировать измерение скрытых переменных. Самая простая и лучшая модель объяснения доступных данных (окончательная модель) — это модель, поддерживающая гипотетический общий путь, определенный на основе критериев согласия.Степень соответствия оценивалась с использованием трех индексов [39, 40]: критерия хи-квадрат, стандартизированного среднеквадратичного остатка (SRMR) и инкрементного сравнительного индекса соответствия (CFI) Бентлера. Незначимые p-значения при пороге 0,05 для критерия хи-квадрат, значения SRMR ниже 0,08 и значение CFI Бентлера выше 0,95 указывают на хорошее соответствие. Результаты моделирования структурным уравнением были представлены в виде стандартизированных оценок βstd и p-значений. Стандартизированные оценки представляют собой ожидаемое изменение единиц стандартного отклонения переменной из-за увеличения одного стандартного отклонения другого.В качестве представления без единиц измерения они позволяют сравнивать относительную силу ассоциаций и, таким образом, упрощают интерпретацию коэффициентов.

Анализ чувствительности.

Мы рассмотрели использование процента HLA-DR + Т-клеток среди CD8 + Т-лимфоцитов крови как результат для определения хронической иммунной активации в HLA-A * 0201-положительном образце. Кроме того, был проведен анализ всего образца с учетом ЦМВ-индуцированного иммунного ответа, измеренного с помощью Quantiferon-CMV (положительный, т.е.е. ≥ 0,2 МЕ / мл по сравнению с отрицательным, т.е. <до 0,2 МЕ / мл) и аутоиммунный иммунный ответ, измеренный титрами антиядерных антител (положительный, т.е. ≥ 1: 250 по сравнению с отрицательным, то есть <1: 250).

Результаты

Характеристики пациентов

Всего в исследование ACTHIV был включен 191 пациент (женщины: 25%). Средний возраст включения составил 50 лет (43; 58). Средняя продолжительность вирусной супрессии составила 6,1 года (4; 8,5). Медиана количества CD4 + и CD8 + Т-клеток составляла 517 клеток / мкл (387; 720) и 676 клеток / мкл (480; 977).Пациенты имели средний надир CD4 + 188 клеток / мкл (89; 275).

Из 191 пациента 87 были HLA-A * 0201 положительными пациентами. Не было различий между пациентами с HLA-A2 и общей популяцией, за исключением возможности измерения процентного содержания CMV-pp65-специфичных тетрамеров CD8 + и актин-, виментиновых, ламин-специфичных CD8 + Т-клеток в HLA-A *. 0201 популяция (ограниченные тесты).

Демографические, клинические и биологические характеристики 87 HLA-A * 0201 положительных пациентов были репрезентативными для общей популяции из 191 пациента (таблицы 1A и 1B).

Измерение процессов

Основные характеристики пациента переменных, связанных с ЦМВ, аутоиммунными иммунными ответами и микробной транслокацией, представлены в таблице 1B. В общей популяции квантиферон-ЦМВ был положительным у 78% пациентов, а антинуклеарные антитела были положительными у 26% пациентов. У пациентов с положительной реакцией на HLA-A * 0201 Quantiferon-CMV был положительным у 82%, а антинуклеарные антитела были положительными у 28% пациентов. Уровни тестируемых аутоантиген-специфичных Т-клеток в этом исследовании были низкими.Уровни 16SrDNA и sCD14 для изучения микробной транслокации не различались между HLA-A * 0201-положительными пациентами и общей популяцией (Таблица 1B).

Из 87 HLA-A * 0201-положительных пациентов основной полный анализ был проведен у 57 пациентов, у которых процентное содержание актин-, виментин-, ламин-специфичных CD8 + Т-клеток, а также Quantiferon, pp-65 ELISPOT для ЦМВ были доступны (пациенты с отсутствующими значениями переменных, включенных в модель, были исключены). Остальные 30 пациентов не отличались от 57 пациентов с положительной реакцией на HLA-A * 0201, включенных в окончательный анализ.У 57 пациентов средний% HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клеток составлял 15,8 (11,7; 23,2). Медиана% актин-специфических CD8 + Т-клеток,% виментина-специфичных-CD8 + Т-клеток,% ламин-специфичных CD8 + Т-клеток составляла соответственно 0,03 (0,02; 0,06), 0,01 (0,01; 0,02) и 0,01 (0,01; 0,02). Медианные значения Quantiferon-CMV составляли 5,3 МЕ / мл (0,4; 11,5), а медианные значения CMV-pp65-ELISPOT составляли 309 (95; 645). Измерения экспрессии гена IFN-α положительно и достоверно коррелировали с процентным содержанием HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клеток (рис. 2).

Рис. 2. Корреляция Спирмена между процентами CD8 + CD38 + HLA-DR + Т-клеток и измерениями экспрессии гена IFN-α, HLA-A * 0201 положительные пациенты (n = 57).

Исследование ACTHIV . A) ADAR : r = 0 . 31 , p-значение = 0 . 0180; Б) ISG15 : r = 0 . 34 , p-значение = 0 . 0085; В) IFIT1 : r = 0 . 32 , p-значение = 0 . 0166; Г) Mx1 : r = 0 . 29 , p-значение = 0 . 0301; E) OAS1 : r = 0 . 35 , p-значение = 0 . 0077 .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164.g002

Основной интегративный анализ у HLA-A * 0201 положительных пациентов

Модель здания.

Построение модели началось с модели, представленной на рис. 1. Поскольку биомаркеры микробной транслокации не были связаны с хронической иммунной активацией в однофакторном анализе (эффект 16SrDNA: p-value = 0.6100; Эффект sCD4: p-значение = 0,9750; латентная переменная микробной транслокации: p-значение = 0,9922), и в многомерном анализе, выполненном в нашей предыдущей работе [24], они были исключены из окончательной модели. Антиядерные антитела не способствовали определению латентной переменной аутоиммунного иммунного ответа (значение p = 0,2785), а также Т-лимфоцитов CD8 +, специфичных для CMV-pp65, для определения латентного иммунного ответа, индуцированного CMV. переменная (p-значение = 0,7049). Следовательно, дальнейшие анализы включали влияние CMV-индуцированного иммунного ответа, измеренного с помощью Quantiferon и pp-65 ELISPOT, аутоиммунного иммунного ответа, измеренного с помощью актина, виментина, ламин-специфического пути CD8 +, интерферона-α, измеренного уровнем экспрессии пяти сигнальные гены интерферона (ADAR, ISG15, IFIT1, Mx1 и OAS1) и хроническая иммунная активация.

Окончательная модель.

Окончательная модель наилучшего соответствия для данных ACTHIV показана на рисунке 3, а соответствующие результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние цитомегаловирусных, аутоиммунных иммунных ответов на хроническую иммунную активацию (HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клетки log10%), HLA-A * 0201 положительных пациентов (n = 57).

Основной интегративный анализ для чтения вместе с рис. 3. Исследование ACTHIV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164.t002

Рис. 3. Окончательная гипотетическая модель, представляющая эффекты латентных переменных, индуцированных цитомегаловирусом, аутоиммунных иммунных ответов на хроническую иммунную активацию.

Рисунок, который следует читать вместе с , Таблица 2. Исследование ACTHIV . Ящики : наблюдаемых переменных; эллипсы : скрытые переменные; ошибки измерения удалены для ясности . * p-значения <0 . 05 . ** p-значения <0 . 0001 .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164.g003

Квантиферон-ЦМВ (βstd = 0,61) и CMV-pp-65-ELISPOT (βstd = 0,51) внесли значительный вклад в вызванный ЦМВ ответ. Положительные статистически значимые стандартизованные оценки означают, что более высокие уровни CMV-индуцированного ответа были связаны с более высокими уровнями Quantiferon-CMV и CMV-pp-65-ELISPOT. Аутоиммунно-индуцированный ответ состоял из% актин-специфических CD8 + Т-клеток,% виментина-специфичных-CD8 + Т-клеток и% ламин-специфических CD8 + Т-клеток.Все стандартизированные оценки были положительными. Процент виментин-специфических CD8 + Т-клеток представлял наибольший вклад в объяснение аутоиммунно-индуцированной вариации ответа (βstd = 0,52, значение p = 0,0006). Латентная переменная гена IFN-α состояла из уровней экспрессии генов, стимулированных IFN-α: ADAR (βstd = 0,59), ISG15 (βstd = 0,54), IFIT1 (βstd = 0,94), Mx1 (βstd = 0,93), OAS1 (βstd). = 0,77).

Анализ эффекта каждого отдельного процесса выявил прямую связь хронической иммунной активации CD8 + Т-клеток с CMV-индуцированным ответом (βstd = 0.42, значение p = 0,0232), и с генами IFN-α (βstd = 0,31, значение p = 0,0093). Не было обнаружено прямого эффекта аутоиммунного ответа и хронической иммунной активации (βstd = 0,04, p-значение = 0,7361). Однако аутоиммунный ответ был связан с генами IFN-α (βstd = 0,33, значение p = 0,0457).

Структурная модель, включающая все процессы, представленные на рис.0004), но не имеет значимой связи с генами IFN-α (значение p = 0,9069). Не было прямой значимой связи аутоиммунного ответа и хронической иммунной активации (значение p = 0,3169). Влияние аутоиммунного ответа на хроническую иммунную активацию было косвенным через гены IFN-α: аутоиммунный ответ был значительно связан с генами IFN-α (βstd = 0,36, p-значение = 0,0401), а гены IFN-α были связаны с генами IFN-α. хроническая активация иммунной системы (βstd = 0,39, значение p = 0.0044). Качество подгонки модели было удовлетворительным (p-значение хи-квадрат = 0,32; SRMR = 0,07; CFI = 0,98). Эти результаты сохранились после поправки на возраст, количество CD4 + T-клеток и количество регуляторных T-клеток (таблица S2).

При определении активации CD8 + T-клеток с% CD8 + HLA-DR + T-клеток (log 10 преобразованных) вместо% CD8 + CD38 + HLA-DR + в качестве результата, скорректированные результаты согласовывались (таблица S3). Было обнаружено прямое положительное значимое влияние CMV-индуцированного ответа на хроническую иммунную активацию (βstd = 0.45, значение p = 0,0056), а также косвенное влияние аутоиммунного ответа на хроническую иммунную активацию через гены IFN-α. Аутоиммунный ответ был значительно связан с генами IFN-α (βstd = 0,35, p-значение = 0,0345), а гены IFN-α были связаны с хронической иммунной активацией (βstd = 0,35, p-value = 0,0111).

Анализ чувствительности в общей популяции.

Из 191 пациента, включенного в исследование ACTHIV, анализ чувствительности был проведен у 142 пациентов, у которых Quantiferon-CMV положительный по сравнению с отрицательным, титры антиядерных антител положительные по сравнению с отрицательными, интерферон-стимулированные гены и% HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клетки были доступны (включая 57 пациентов из основного интегративного анализа).У этих пациентов средний% HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клеток составлял 16,9 (10,8; 23,7), Quantiferon-CMV был положительным у 78% пациентов, а антинуклеарные антитела были положительными у 23% пациентов. Скорректированные результаты примерно соответствовали предыдущим результатам (таблица S4). Положительность квантиферона-ЦМВ была связана с более высоким процентом CD8 + CD38 + HLA-DR + (βstd = 0,15, p-значение = 0,0648), положительные титры антиядерных антител были связаны с более высокой экспрессией генов IFN-α (βstd = 0,16, p-значение = 0.0797) и более высокая экспрессия гена IFN-α была связана с хронической иммунной активацией (βstd = 0,22, значение p = 0,0120).

Обсуждение

Изучение механизмов, управляющих хронической активацией иммунной системы у успешно пролеченных ВИЧ-инфицированных пациентов, требует подхода статистического моделирования. Тестируемые пути должны быть определены априори, а гипотезы относительно взаимосвязей между многофакторными триггерами, вовлеченными в хронический ВИЧ, должны быть опровергнуты этим подходом. Общие стратегии для нескольких маркеров состоят в том, чтобы анализировать каждый маркер отдельно или одновременно включать исходные маркеры в качестве предикторов в модели многовариантной регрессии, предполагая наличие одной единственной связи между переменными.В дополнение к пренебрежению какими-либо априорными знаниями, эти стратегии могут привести к недействительности результатов из-за: i) увеличения ошибок типа I в результате нескольких тестов, ii) ошибок типа II (отсутствие истинных ассоциаций), поскольку иммунные маркеры отражают только небольшую часть вариации. основного иммунологического механизма, iii) проблемы оценки из-за мультиколлинеарности или игнорирования ошибок измерения. Таким образом, чтобы разгадать сложность исследовательских вопросов, которыми занимаются современные иммунологические исследования, необходимы сложные статистические подходы [41–44].

В этом исследовании мы рассмотрели возможность использования SEM для изучения опосредующей роли INF-α в хронической иммунной активации у успешно пролеченных ВИЧ-инфицированных пациентов. Преимущество SEM заключается в использовании всей доступной информации в интегративном анализе, избегая методологических проблем, упомянутых выше. Более того, скрытые переменные определяются несколькими маркерами, которые могут отражать лежащий в основе иммунологический механизм, а SEM учитывает априорные знания, ограничивающие количество выполняемых анализов и множественных тестов.Из-за наличия процентного содержания актин-, виментиновых, ламин-специфичных CD8 + Т-клеток (тесты с ограничением HLA-A2) для дальнейшей характеристики аутоиммунного ответа, мы выполнили наш основной анализ на подвыборке пациентов с HLA-A2, в целом исследование оригинала по сравнению с ранее опубликованным [24]. Опосредованная роль INF-α была исследована, и лежащие в основе процессы активации были определены как латентные переменные, т.е. иммунные ответы, индуцированные CMV, аутоиммунные реакции, микробная транслокация и INF-α.Наилучшая модель объяснения доступных данных была определена на основе критериев согласия.

Окончательные результаты

SEM показали прямое положительное значимое влияние CMV-индуцированного ответа и генов IFN-α на хроническую иммунную активацию. Кроме того, этот подход может предполагать косвенный эффект аутоиммунного ответа на хроническую активацию иммунной системы через гены IFN-α. Эти результаты были согласованы в различных анализах чувствительности, проведенных у HLA-A * 0201 положительных пациентов и в общей популяции.Результаты в общей популяции можно объяснить тем фактом, что положительность квантиферона-ЦМВ и положительность титров антиядерных антител могут быть недостаточно точными для отражения, соответственно, ответа, индуцированного ЦМВ, и аутоиммунного ответа, приводящего к смещению разведения и лежащему в основе необходимость комплексного анализа с использованием всей доступной информации.

В частности, все анализы подчеркнули значительный эффект генов IFN-α на хроническую активацию иммунной системы, учитывая доказательства участия пути IFN-α в хронической иммунной активации у успешно пролеченных ВИЧ-1-инфицированных пациентов [10–12 ].

Мы подтвердили влияние ЦМВ-индуцированного ответа на хроническую активацию иммунной системы [24]. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями, подчеркивающими участие ЦМВ в иммунном старении и хронической ВИЧ-инфекции [45–49]. Согласно этому новому анализу, влияние CMV-индуцированного ответа на активацию CD8 + Т-клеток не было опосредовано генами IFN-α, измеренными в настоящем исследовании (ADAR, ISG15, IFIT1, Mx1 и OAS1). Прямое влияние CMV-индуцированного ответа на хроническую иммунную активацию было выявлено с помощью измерений Quantiferon и pp-65 ELISPOT.CMV-тетрамер-pp65-специфические CD8 + Т-клетки не способствовали определению латентной переменной CMV-индуцированного иммунного ответа (p = 0,7049). Stone et al [50] сообщили, что процентное содержание CMV-pp65-специфических CD8 + Т-клеток было одинаковым у ВИЧ-инфицированных пациентов со стабильной неопределяемой ВИЧ-виремией из-за высокоактивной антиретровирусной терапии и здоровых лиц из контрольной группы. Взятые вместе, эти результаты показывают, что CMV-pp65-специфические CD8 + Т-клетки в циркулирующей крови могут не отражать точно статус ответа против CMV и, таким образом, ставят под сомнение уместность их измерения на расстоянии от первичной инфекции или реактиваций. в крови.Действительно, ответ против ЦМВ может в первую очередь зависеть от резидентных в ткани Т-клеток памяти [51], которые не рециркулируют в крови, а остаются в барьерной ткани, такой как легкие, кожа или кишечник. Следовательно, отсутствие корреляции между тетрамер-положительными Т-клетками и ЦМВ не означает, что их не существует, но что они не циркулируют в исследуемой нами крови.

Интересно, что наши результаты могут указывать на косвенный эффект аутоиммунного ответа на хроническую иммунную активацию, опосредованную генами IFN-α.Даже при отсутствии клинических проявлений биологические сигналы низкого уровня могут иметь такие последствия, как активация Т-клеток. Влияние аутоиммунного иммунного ответа на латентную переменную IFN-α было выявлено путем измерения актин-, виментин-, ламин-специфичных CD8 + Т-клеток, что свидетельствует о важной роли расщепленных каспазой апоптотических аутоантигенов в иммунной активации во время хроническая ВИЧ-инфекция, как было предложено Rawson et al [23]. Следует отметить, что процент виментин-специфичных CD8 + Т-клеток внес наибольший вклад в определение латентной переменной аутоиммунного ответа.Более того, использование латентной переменной казалось особенно актуальным в отношении низких уровней аутоантиген-специфичных Т-клеток в этом исследовании. Действительно, антиядерные антитела не способствовали определению латентной переменной аутоиммунного ответа и были исключены из окончательной модели. Последний результат показывает необходимость измерения биомаркеров, более значимых, чем антиядерные антитела, при изучении аутоиммунного ответа при хроническом ВИЧ [23]. В целом, эти результаты могут дать ценную информацию в гипотезах относительно роли аутоиммунитета, поскольку в литературе было очень мало сообщений, посвященных изучению аутоиммунитета у ВИЧ-инфицированных пациентов [22].Однако эти результаты необходимо интерпретировать осторожно, потому что: i) не было прямой значимой связи аутоиммунного ответа с хронической иммунной активацией, ii) даже несмотря на то, что использование латентной переменной казалось особенно актуальным для определения аутоиммунного иммунного ответа, очень низкие уровни аутоантиген-специфичных Т-клеток в этом исследовании могут вызвать опасения по поводу существования биологического аутоиммунитета, в достаточной степени влияющего на активацию иммунной системы.

Предыдущие исследования показали, что бактериальная транслокация (измеряемая с помощью sCD14 и 16SrDNA) была связана с активацией иммунной системы.В этой работе биомаркеры микробной транслокации не были связаны с хронической иммунной активацией в однофакторном анализе и в многомерном анализе, выполненном в нашей предыдущей работе [24]. Это можно объяснить очень специфическими характеристиками нашей популяции: средняя продолжительность вирусной супрессии 5,8 лет (IQR: 4,4; 7,7), средняя продолжительность воздействия АРТ 10,5 лет (5,9; 13,4), с очень низкими уровнями микробной транслокации: медиана sCD14 мкг / мл 1,8 (1,6; 1,9), медиана 16S рДНК log10 копий / мл 3.3 (3,1; 3,4) (данные для пациентов с HLA-A2). Более того, Abad-Fernandez M и др. Не обнаружили какой-либо корреляции между sCD14 или бактериальной рДНК с активированными CD8 T-клетками у людей, инфицированных ВИЧ-1 в течение длительного времени [52].

Наше исследование также имело некоторые ограничения. Во-первых, исследование ACTHIV — это перекрестное исследование, входящее в состав Аквитанской когорты ANRS CO3, не позволяющее сделать вывод о временном характере и причинном направлении наблюдаемых ассоциаций. Включенные в исследование пациенты начали антиретровирусную терапию в период с 2005 по 2008 год и были подавлены вирусом в течение как минимум двух лет.Средняя продолжительность вирусной супрессии составила 6,1 года (4; 8,5) в популяции в целом и 5,8 года (4,4; 7,7) в популяции HLA-A2. Других данных о стойкой продолжающейся репликации ВИЧ у нас не было. Это явное ограничение исследования. Во-вторых, несмотря на то, что наши результаты были подтверждены во всех анализах чувствительности, основной полный интегративный анализ случая был проведен у 66% (57/87) HLA-A * 0201 положительных пациентов, что объясняет потенциальную нехватку мощности, которая могла повлиять на результаты эффекты аутоиммунитета и идентифицируемости модели SEM (как правило, чем выше сложность модели, тем больше требуется наблюдений), что ставит под сомнение необходимость в дополнительных методах, таких как множественное вменение.В-третьих, у нас было только пять количественных измерений экспрессии генов, стимулированных IFN-α. В некоторых исследованиях сообщается о более специфических путях IFN-α, которые могут быть вовлечены в хроническую иммунную активацию ВИЧ, т.е. IFN-α MYD88-зависимый путь и IFN-α MYD88 независимый путь [53–55]. Дополнительные данные об этих путях, возможно, помогли лучше охарактеризовать потенциальные косвенные эффекты ЦМВ или микробной транслокации на хроническую иммунную активацию. Необходимы дальнейшие исследования, которые могут быть реализованы в рамках продольного анализа, позволяющего сделать вывод о причинно-следственных связях.Комбинирование соответствующих биомаркеров и адекватных количественных измерений экспрессии генов, включая IFN-α, с использованием моделирования структурным уравнением также может применяться в продольном анализе данных [56]. Действительно, предпринимаются постоянные попытки идентифицировать и лучше охарактеризовать ландшафт стимулированных IFN-α генов [57, 58].

Мы сосредоточились на хронической иммунной активации Т-клеток, которая, как доказано, является ведущим фактором прогрессирования ВИЧ-инфекции, но мы признаем важность других маркеров, включая В-клетки, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, моноциты, макрофаги и нейтрофилы каскада воспаления. а также эндотелия и системы свертывания крови при активации иммунной системы [59].Мы действительно считаем, что это исследование дополнительно иллюстрирует потенциал латентных переменных в современной иммунологии для оценки биологических процессов, которые нельзя измерить напрямую.

В этом исследовании мы использовали анализ моделирования структурных уравнений, чтобы определить, подтверждается ли наша гипотетическая теоретическая модель (рис. 1) выборочными данными, отражающими нашу теорию о хроническом ВИЧ. Самая простая и лучшая модель объяснения имеющихся данных, поддерживающих предполагаемый общий путь (рис. 3), прошла тесты согласия.По мере того как методы оценки, возможности моделирования и широта применения СЭМ быстро расширяются за пределы социальных наук, охватывая множество областей, таких как современная иммунология [41, 43, 44], эндокринология [60], рак [61, 62] или окружающая среда [63]. , мы хотели бы предупредить читателей о результатах SEM, которые необходимо интерпретировать с осторожностью. В самом деле, то, что модель хорошо соответствует данным, не означает, что модель полностью отражает реальность. Другие статистические правдоподобные модели могли бы соответствовать данным [29], но преимущество SEM состоит в том, чтобы учитывать предварительные знания, ограничивающие количество выполняемых анализов и множественное тестирование.Вот почему, помимо необходимости сообщать подробное статистическое обоснование модели (спецификация, идентифицируемость, оценка, степень соответствия) [29], мы подчеркиваем важность интеграции опыта специалистов в данной области при определении тестируемых путей и при построении исходной гипотетической теоретической модели. В частности, тщательно проведенный SEM-анализ с минимальным количеством слабых допущений является важным дополнением к стандартным результатам регрессии (например, посредничество, ошибка измерения в независимых переменных).В заключение, это исследование не только дает ценную информацию о механизмах, лежащих в основе хронической иммунной активации при ВИЧ-инфекции, но также демонстрирует потенциал SEM для управления множественными взаимосвязями, понимания эпидемиологических процессов с использованием данных наблюдений. Кроме того, результаты ясно указывают на необходимость интегративного анализа, чтобы максимально использовать иммунологические данные [64, 65]. Используя эту гибкую структуру, была подтверждена роль ЦМВ-иммунного ответа на активацию CD8 + Т-клеток, поощряя вмешательство против ЦМВ у успешно пролеченных ВИЧ-1-инфицированных пациентов [21, 66].Наши результаты также дополняют растущее количество доказательств того, что IFN-α участвует в хронической иммунной активации. Обнаруженный сигнал о потенциальной роли аутоиммунного ответа в хронической иммунной активации требует дальнейших исследований.

Дополнительная информация

S2 Таблица. Влияние цитомегаловирусных, аутоиммунных иммунных ответов на хроническую активацию иммунной системы (HLA-DR + / CD38 + CD8 + Т-клетки log10%) с поправкой на возраст, количество CD4 + Т-клеток и количество регуляторных Т-клеток.

HLA-A * 0201 положительный пациент (n = 57), исследование ACTHIV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164.s002

(DOCX)

S3 Таблица. Влияние цитомегаловирусных, аутоиммунных иммунных ответов на хроническую активацию иммунной системы (% HLA-DR + / CD8 +) с поправкой на возраст, количество CD4 + T-клеток и количество регуляторных T-клеток.

HLA-A * 0201 положительный пациент (n = 57), исследование ACTHIV.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0169164.s003

(DOCX)

Благодарности

Благодарим всех пациентов за участие.Мы благодарим техников из рутинной иммунологической лаборатории CHU Bordeaux за отличную техническую помощь.

Авторы

Членами когортной группы ANRS CO3 Aquitaine являются: Координатор: F. Bonnet, F. Dabis; Научный комитет: Ф. Бонне, С. Буше, Д. Брей, Г. Шен, Ф. Даби, М. Дюпон, Х. Флери, В. Габорио, Д. Лакост, Д. Мальви, П. Мерсье, П. Morlat, D. Neau, I. Pellegrin, JL. Пеллегрин, С. Рейгадас, С. Чамгуэ; Эпидемиология и методология: М.Бруян, Дж. Шене, Ф. Дабис, К. Фагард, С. Лоусон-Аяи, Л. Ришерт, Р. Тьебо, Л. Витткоп; Инфекционные болезни и внутренняя медицина: К. Андре, Ф. Бонне, Н. Бернар, О. Каубе, Л. Конегр, К. Казанаве, Дж. Чеккальди, И. Шоссат, К. Курто, Ф.А. Доши, С. Де Витте, Д. Дондиа, М. Дюпон, А. Дюпон, П. Даффо, Х. Дютрон, С. Фарбос, И. Фор, В. Габорио, Ю. Жерар, К. Грейб, М. Хессамфар -Joseph, Y. Imbert, D. Lacoste, P. Lataste, E. Lazaro, D. Malvy, J. Marie, M. Mechain, JP. Меро, П.Mercié, E. Monlun, P. Morlat, D. Neau, A. Ochoa, JL. Pellegrin, M. Pillot-Debelleix, T. Pistone, I. Raymond, MC. Receveur, P. Rispal, L. Sorin, S. Tchamgoué, C. Valette, MA. Ванденхенде, Миссури. Варейл, Дж. Ф. Виаллард, Х. Вилле, Г. Вирт; Иммунология: JF. Моро, И. Пеллегрен; Вирусология: H. Fleury, ME. Лафон, С. Рейгадас, П. Тримуле.

Фармакология : S. Bouchet, D. Breilh, F. Haramburu, G. Miremont-Salamé; Сбор данных, управление проектами и статистический анализ: МДж.Блейзо, И. Креспель, М. Декуан, С. Дельво, Ф. Диарра, К. Д’Ивернуа, К. Ханапье, Д. Лакост, С. Лоусон-Аяи, О. Леле, Ф. Ле Марек, Э. Лено , Дж. Мурали, Э. Перно, А. Пуже, Б. Увамалия-Нзиюмвира, А. Царанази, А. Вальдес; Отдел информационных технологий и разработка eCRF: В. Конте, И. Луи, Г. Палмер, В. Саппаррарт, Д. Тушар; Центр биологических ресурсов — CHU de Bordeaux: C. Le Scanf-Terrien, I. Pellegrin.

Вклад авторов

  1. Концептуализация: IP JFM RT.
  2. Обработка данных: IP JB JFM PB FB.
  3. Формальный анализ: MQP CPL BL LW RT.
  4. Получение финансирования: ИП RT.
  5. Исследование: IP JB JFM PB FB.
  6. Методология: LW RT MQP CPL BL.
  7. Администрация проекта: MQP IP PB RT.
  8. Ресурсы: IP JB JFM PB FB.
  9. Программное обеспечение: MQP CPL BL.
  10. Контроль: MQP IP PB RT.
  11. Проверка: MQP CPL BL LW RT.
  12. Визуализация: MQP IP JB LW CPL BL JFM FB PB RT.
  13. Написание — первоначальный эскиз: MQP RT.
  14. Написание — просмотр и редактирование: MQP IP JB LW CPL BL JFM FB PB RT.

Список литературы

  1. 1. Дикс С.Г., Китчен СМ, Лю Л., Го Х., Гаскон Р., Нарваез А.Б. и др. Уставка иммунной активации на ранней стадии ВИЧ-инфекции предсказывает последующие изменения CD4 + Т-клеток независимо от вирусной нагрузки.Кровь 2004, 15 августа; 104 (4): 942–7. pmid: 15117761
  2. 2. Содора Д.Л., Сильвестри Г. Активация иммунитета и патогенез СПИДа. AIDS 2008, 19 февраля; 22 (4): 439–46. pmid: 18301056
  3. 3. Hsue PY, Deeks SG, Hunt PW. Иммунологические основы сердечно-сосудистых заболеваний у ВИЧ-инфицированных взрослых. J Infect Dis, июнь 2012; 205 Приложение 3: S375–82.
  4. 4. Плэгер С.Ф., Коллинз Б.С., Мусиб Р., Дикс С.Г., Рид С., Эмбри А. Активация иммунитета в патогенезе пролеченного хронического заболевания ВИЧ: резюме семинара.Ретровирусы AIDS Res Hum, май 2012 г .; 28 (5): 469–77.
  5. 5. Тебас П., Генри В.К., Матининг Р., Вен-Чернг Д., Шмитц Дж., Вальдез Х. и др. Эффекты метаболической и иммунной активации прерывания лечения при хронической ВИЧ-1-инфекции: последствия для сердечно-сосудистого риска. PloS One 2008; 3 (4): e2021. pmid: 18431498
  6. 6. Наси М., Де Биази С., Гибеллини Л., Бьянкини Э, Пекорини С., Бакка В. и др. Старение и воспаление у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Clin Exp Immunol 2016 20 мая [Epub].
  7. 7. Тейджаро Дж. Р., Нг Си, Ли А.М., Салливан Б.М., Шихан К.С., Уэлч М. и др. Стойкая инфекция LCMV контролируется блокадой передачи сигналов интерферона I типа. Science 2013 12 апреля; 340 (6129): 207–11. pmid: 23580529
  8. 8. Wilson EB, Yamada DH, Elsaesser H, Herskovitz J, Deng J, Cheng G и др. Блокада хронической передачи сигналов интерферона типа I для контроля стойкой инфекции LCMV. Science 2013 12 апреля; 340 (6129): 202–7. pmid: 23580528
  9. 9. Чжоу И, Чжан И, Мурман Дж. П., Яо Ц., Цзя Ц.Вирусная (вирус гепатита С, вирус гепатита В, ВИЧ) персистентность и иммунный гомеостаз. Иммунология, ноябрь 2014 г .; 143 (3): 319–30. pmid: 24965611
  10. 10. Acchioni C, Marsili G, Perrotti E, Remoli AL, Sgarbanti M, Battistini A. IFN типа I — тупое копье в борьбе с инфекцией ВИЧ-1. Cytokine Growth Factor Rev 2015 Apr; 26 (2): 143–58. pmid: 25466629
  11. 11. Ча Л., Берри С.М., Нолан Д., Кастли А., Фернандес С., французский Массачусетс. Интерферон-альфа, активация иммунной системы и иммунная дисфункция при лечении ВИЧ-инфекции.Clin Transl Immunology 2014, 28 февраля; 3 (2): e10. pmid: 25505958
  12. 12. Ries M, Pritschet K, Schmidt B. Блокирование выработки интерферона I типа: новый терапевтический вариант для снижения иммунной активации, индуцированной ВИЧ-1. Clin Dev Immunol 2012; 2012: 534929. pmid: 22203858
  13. 13. Раджасуриар Р., Хури Дж., Камарулзаман А., Французский MA, Кэмерон PU, Левин С.Р. Стойкая активация иммунной системы при хронической ВИЧ-инфекции: работают ли какие-либо вмешательства? AIDS 2013, 15 мая; 27 (8): 1199–208.pmid: 23324661
  14. 14. Аппай В., Соус Д. Активация иммунитета и воспаление при ВИЧ-1-инфекции: причины и последствия. Дж. Патол, январь 2008 г .; 214 (2): 231–41. pmid: 18161758
  15. 15. Бренчли Дж. М., Прайс Д. А., Шакер Т. В., Ашер Т. Е., Сильвестри Дж., Рао С. и др. Микробная транслокация является причиной системной иммунной активации при хронической ВИЧ-инфекции. Nat Med 2006 Dec; 12 (12): 1365–71. pmid: 17115046
  16. 16. Клатт Н.Р., Фундербург Н.Т., Бренчли Дж. М..Микробная транслокация, активация иммунной системы и ВИЧ-инфекция. Тенденции Microbiol 2013, январь; 21 (1): 6–13. pmid: 23062765
  17. 17. Цзян В., Ледерман М.М., Хант П., Зиг С.Ф., Хейли К., Родригес Б. и др. Уровни бактериальной ДНК в плазме коррелируют с активацией иммунитета и степенью восстановления иммунитета у лиц с ВИЧ-инфекцией, принимающей антиретровирусные препараты. Журнал Infect Dis 1999 (8): 1177–85.
  18. 18. Appay V, Fastenackels S, Katlama C, Ait-Mohand H, Schneider L, Guihot A и др.Старость и антицитомегаловирусный иммунитет связаны с измененным восстановлением Т-клеток у ВИЧ-1-инфицированных пациентов. AIDS 2011 24 сентября; 25 (15): 1813–22. pmid: 21412126
  19. 19. Hsue PY, Hunt PW, Sinclair E, Bredt B, Franklin A, Killian M и др. Увеличение толщины интима-медиа сонных артерий у пациентов с ВИЧ связано с усилением специфичных для цитомегаловируса Т-клеточных ответов. СПИД 2006; 20: 2275–2283. pmid: 17117013
  20. 20. Парринелло С.М., Синклер Э., Ландей А.Л., Лурайн Н., Шарретт А.Р., Ганге С.Дж. и др.Иммуноглобулин G к цитомегаловирусу ассоциирован с субклиническим заболеванием сонной артерии у ВИЧ-инфицированных женщин. J Infect Dis. 2012; 205: 1788–1796. pmid: 224
  21. 21. Hunt PW, Martin JN, Sinclair E, Epling L, Teague J, Jacobson MA и др. Валганцикловир снижает активацию Т-клеток у ВИЧ-инфицированных лиц с неполным восстановлением CD4 + Т-клеток на антиретровирусной терапии. J Infect Dis 2011 15 мая; 203 (10): 1474–83. pmid: 21502083
  22. 22. Страттон Р., Слапак Дж., Махунгу Т., Кинлох-де Лоэс С.Аутоиммунитет и ВИЧ. Curr Opin Infect Dis 2009, февраль; 22 (1): 49–56. pmid: 19532080
  23. 23. Rawson PM, Molette C, Videtta M, Altieri L, Franceschini D, Donato T. и др. Перекрестная презентация расщепленных каспазой апоптотических аутоантигенов при ВИЧ-инфекции. Nat Med, декабрь 2007 г .; 13 (12): 1431–1431. pmid: 18026114
  24. 24. Витткоп Л., Битард Дж., Лазаро Э., Неау Д., Боннет Ф, Мерси П. и др. Влияние иммунного ответа, индуцированного цитомегаловирусом, иммунного ответа, индуцированного аутоантигеном, и микробной транслокации на хроническую активацию иммунной системы у успешно пролеченных пациентов с ВИЧ-инфекцией типа 1: когорта ANRS CO3 Aquitaine.J Infect Dis 2013, 15 февраля; 207 (4): 622- pmid: 23204178
  25. 25. Banchereau J, Pascual V. Интерферон типа I при системной красной волчанке и других аутоиммунных заболеваниях. Иммунитет 2006 Сентябрь; 25 (3): 383–92. pmid: 16979570
  26. 26. Blanco P, Palucka AK, Pascual V, Banchereau J. Дендритные клетки и цитокины при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях человека. Cytokine Growth Factor Rev 2008 Feb; 19 (1): 41–52. pmid: 18258476
  27. 27. Кинлок А.Дж., Чанг А., Ко К., Генри Дананд С.Дж., Хендерсон С., Майеншайн-Клайн М. и др.Виментин является доминирующей мишенью гуморального иммунитета in situ при тубулоинтерстициальном нефрите волчанки человека. Arthritis Rheumatol, декабрь 2014 г .; 66 (12): 3359–70. pmid: 25306868
  28. 28. Ян С., Неттервальд Дж., Ван В., Чжу Х. Характеристика элементов и белков, ответственных за индукцию индуцированного интерфероном гена цитомегаловирусом человека. J Virol 2005, апрель; 79 (8): 5027–34. pmid: 15795288
  29. 29. Санчес Б.Н., Будц-Йоргенсен Э., Райан Л.М. и Ху Х. Модели структурных уравнений: обзор с применением в экологической эпидемиологии.JASA 2005; 100 (472): 1443–55.
  30. 30. Тибо Р., Морлат П., Жакмин-Гадда Х., Неау Д., Мерси П., Дабис Ф. и др. Клиническое прогрессирование инфекции ВИЧ-1 в соответствии с вирусным ответом в течение первого года антиретровирусного лечения. Groupe d’Epidemiologie du SIDA en Aquitaine (GECSA). AIDS 2000, 26 мая; 14 (8): 971–8. pmid: 10853978
  31. 31. Ивашкив ЛБ, Донлин ЛТ. Регуляция интерфероновых ответов типа I. Обзоры Nature Immunology 2014, январь; 14 (1): 36–49. pmid: 24362405
  32. 32.Бенито Дж. М., Лопес М., Лозано С., Мартинес П., Гонсалес-Лахос Дж., Сориано В. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах CD8 как маркер остаточной репликации вируса у хронически ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию. Ретровирусы AIDS Res Hum, 2004 г., февраль; 20 (2): 227–33. pmid: 15018711
  33. 33. Blanco P, Pitard V, Viallard JF, Taupin JL, Pellegrin JL, Moreau JF. Увеличение количества активированных CD8 + Т-лимфоцитов, экспрессирующих перфорин и гранзим B, коррелирует с активностью заболевания у пациентов с системной красной волчанкой.Arthritis Rheum 52, 201–11 (2005). pmid: 15641052
  34. 34. Грейс Дж. Б., Школьный учитель Д. Р., Гантенсперген Г. Р., Литтл А. М., Митчелл Б. Р., Миллер К. М. и др. Рекомендации по теоретико-графической реализации моделирования структурных уравнений. Экосфера 2012; 3 (8): 73.
  35. 35. Чаванс М., Эсколано С., Ромон М., Басдеван А., де Лозон-Гийен Б., Шарль М.А. Скрытые переменные и модели структурных уравнений для продольных отношений: иллюстрация в эпидемиологии питания.BMC Med Res Methodol 2010 30 апреля; 10:37. pmid: 20433707
  36. 36. Дали Д.Л., Адэр Л.С., Боллен К.А. Модель структурного уравнения происхождения кровяного давления, связанных с развитием. Int J Epidemiol 2009, апрель; 38 (2): 538–548. pmid: 106
  37. 37. Ливак К.Дж., Шмитген Т.Д. Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 (-Delta Delta C (T)). Методы, декабрь 2001 г., 25 (4): 402–8. pmid: 11846609
  38. 38. Холст К.К. Дж. Э.Модели с линейными скрытыми переменными: пакет lava. Comput Stat 2013; 28: 1385–452.
  39. 39. Хойл Р. Справочник по моделированию структурных уравнений. Нью-Йорк: Guildford Press; 2012.
  40. 40. Ху LT, Бентлер П.М. Критерии отсечения для индексов соответствия в анализе ковариационной структуры: традиционные критерии по сравнению с новыми альтернативами. Моделирование структурных уравнений 1999; 6 (1): 1–55.
  41. 41. Дженсер Б., Купер П.Дж., Язданбахш М., Баррето М.Л., Родригес Л.С. Руководство по современному статистическому анализу иммунологических данных.BMC Immunol 2007 26 октября; 8:27. pmid: 17963513
  42. 42. Ханф М., Геган Дж. Ф., Ахмед И., Нахер М. Распутывая сложность инфекционных заболеваний: пришло время улучшить набор статистических инструментов первого уровня для эпидемиологов. Infect Genet Evol 2014, январь; 21: 497–505. pmid: 24035791
  43. 43. Браун Дж. Р., Стаффорд П., Джонстон С. А., Дину В. Статистические методы анализа иммуносигнатур. BMC Bioinformatics 2011, 19 августа; 12: 349. pmid: 21854615
  44. 44. Тетард-Джонс С., Гейтхаус А.М., Купер Дж., Лейферт С., Раштон С.Моделирование путей к деградации Rubisco: подход к моделированию структурных уравнений. PLoS One 2014 3 февраля; 9 (2): e87597. pmid: 24498339
  45. 45. Фриман М.Л., Ледерман М.М., Джанелла С. Партнеры по преступлению: роль ЦМВ в иммунной дисрегуляции и клинических исходах во время ВИЧ-инфекции. Curr HIV / AIDS Rep., Февраль 2016 г .; 13 (1): 10–9. pmid: 26810437
  46. 46. Джанелла С., Летендре С. Цитомегаловирус и ВИЧ: опасное па-де-де. J Infect Dis 2016, 1 октября; 214 Приложение 2: S67–74.
  47. 47. Лихтнер М., Чиккони П., Вита С., Коззи-Лепри А., Галли М., Ло Капуто С. и др. Коинфекция цитомегаловирусом связана с повышенным риском серьезных событий, не связанных со СПИДом, у большой группы ВИЧ-инфицированных пациентов. J Infect Dis 2015; 211: 178–186. pmid: 25081936
  48. 48. Эффрос РБ. Тихая война ЦМВ при старении и ВИЧ-инфекции. Mech Aging Dev 2016, сентябрь; 158: 46–52. pmid: 26404009
  49. 49. Freeman ML, Mudd JC, Shive CL, Younes SA, Panigrahi S, Sieg SF и др.Экспансия CD8-лимфоцитов и воспаление связаны с коинфекцией ЦМВ при лечении ВИЧ-инфекции, полученной с помощью АРТ. Clin Infect Dis 2015.
  50. 50. Stone SF, Price P, Khan N, Moss PA, French MA. Пациенты с ВИЧ, получающие антиретровирусную терапию, имеют высокие частоты Т-лимфоцитов CD8, специфичных для белка-1 цитомегаловируса немедленного раннего развития. AIDS 2005 24 марта; 19 (6): 555–62. pmid: 15802973
  51. 51. Том Дж. Т., Оксениус А. Резидентные Т-клетки памяти при цитомегаловирусной инфекции. Curr Opin Virol 2016 февраль; 16: 63–9 pm, id: 26855038
  52. 52.Абад-Фернандес М., Вальехо А., Эрнандес-Новоа Б., Диас Л., Гутьеррес С., Мадрид Н. и др. Корреляция между различными методами измерения микробной транслокации и ее связь с активацией иммунной системы у лиц, инфицированных ВИЧ-1 в течение длительного времени. J Acquir Immune Defic Syndr, 1 октября 2013 г .; 64 (2): 149–53. pmid: 24047967
  53. 53. Акира С., Такеда К. Передача сигналов толл-подобных рецепторов. Nat Rev Immunol, июль 2004; 4 (7): 499–511. pmid: 15229469
  54. 54. Кадер М., Смит А.П., Гвидуччи С., Вандерлих Е.Р., Нормолл Д., Уоткинс С.К. и др.Блокирование опосредованной TLR7 и TLR9 продукции IFN-альфа плазматическими дендритными клетками не снижает иммунную активацию при ранней инфекции SIV. PLoS Pathog 2013; 9 (7): e1003530. pmid: 231
  55. 55. Мейер А., Альтер Дж., Фрам Н., Сидху Х., Ли Б., Багчи А. и др. MyD88-зависимая иммунная активация, опосредованная лигандами Toll-подобного рецептора, кодируемыми вирусом иммунодефицита человека типа 1. J Virol 2007, август; 81 (15): 8180–91. pmid: 17507480
  56. 56. Дансон ДБ. Байесовские методы моделирования скрытых признаков продольных данных.Stat Methods Med Res 2007 Октябрь; 16 (5): 399–415. pmid: 17656454
  57. 57. Шнайдер ВМ, Шевиллотт МД, Райс СМ. Гены, стимулированные интерфероном: сложная сеть защитных механизмов хозяина. Анну Рев Иммунол 2014; 32: 513–45. pmid: 24555472
  58. 58. Шоггинс JW, Райс CM. Стимулируемые интерфероном гены и их противовирусные эффекторные функции. Curr Opin Virol 2011 Dec; 1 (6): 519–25. pmid: 22328912
  59. 59. Юнас М., Псомас С., Рейнс Дж., Корбо П. Активация иммунитета в ходе инфекции ВИЧ-1: причины, фенотипы и устойчивость при терапии.HIV Med 2016, февраль; 17 (2): 89–105. pmid: 26452565
  60. 60. Хуанг CY, Лу CW, Лю YL, Chiang CH, Lee LT, Huang KC. Связь между хроническим гепатитом B и метаболическим синдромом: подход моделирования структурного уравнения. Ожирение, февраль 2016; 24 (2): 483–9. pmid: 26719030
  61. 61. Baltar VT, Xun WW, Johansson M, Ferrari P, Chuang SC, Relton C и др. Подход к моделированию структурного уравнения для изучения роли витаминов группы В и иммунных маркеров в риске рака легких. Eur J Epidemiol 2013, август; 28 (8): 677–88.pmid: 23532743
  62. 62. Симидзу Х., Аримура Й., Онодера К., Такахаши Х., Окахара С., Кодайра Дж. И др. Злокачественный потенциал рака желудочно-кишечного тракта, оцениваемый с помощью моделирования структурных уравнений. PLoS One 2016 18 февраля; 11 (2): e0149327. pmid: 26889682
  63. 63. Mogensen UB, Grandjean P, Heilmann C, Nielsen F, Weihe P, Budtz-Jørgensen E. Моделирование структурным уравнением иммунотоксичности, связанной с воздействием перфторированных алкилатов. Environ Health 2015 5 июня; 14:47.pmid: 26041029
  64. 64. Genser B, Fischer JE, Figueiredo CA, Alcântara-Neves N, Barreto ML, Cooper PJ, et al. Прикладные иммуноэпидемиологические исследования: подход для интеграции существующих знаний в статистический анализ множественных иммунных маркеров. BMC Immunol 2016 Май.
  65. 65. Карвер С., Битти Дж. А., Тройер Р. М., Харрис Р. Л., Штутцман-Родригес К., Баррс В. Р. и др. Устранение разрыва в причинных процессах риска заражения на основе перекрестных данных: модели структурных уравнений для понимания инфекции и коинфекции.Parasit Vectors, 23 декабря 2015 г .; 8: 658. pmid: 26701692
  66. 66. Пайардини М., Мюллер-Трутвин М. Хроническая иммунная активация, связанная с ВИЧ. Immunol Rev, июль 2013 г .; 254 (1): 78–101. pmid: 23772616

BlobTools: опрос геномных сборок

Введение

Достижения в технологиях секвенирования следующего поколения позволили получить огромное количество данных и знаний (Goodwin et al ., 2016). Снижение стоимости нуклеотида привело к более широкому применению этих технологий к немодельным организмам, формам жизни, которые до сих пор не были интенсивно изучены научным сообществом.Затем наука об этих видах с помощью генома может пролить свет на новые процессы и выявить закономерности эволюции. Для немодельных видов роскошь большого количества материала из культивируемых изолятов часто невозможна, и исследования должны проводиться на организмах, полученных из дикой природы, или на сложных смесях видов. ДНК, выделенная из образца, может фактически содержать геномы нескольких организмов — источников пищи, материала хозяина, симбионтов, патогенов, комменсалов и внешних загрязнителей — в дополнение к организму-мишени.В некоторых случаях связанные геномы можно рассматривать как «контаминанты», в то время как в других они могут дать представление о биологии организма-мишени. Во всех случаях они должны быть идентифицированы, изолированы и тщательно исследованы.

Опрос ансамблей генома для подтверждения происхождения одного таксона — элементарный шаг в процессе секвенирования генома. Неспособность идентифицировать последовательность, не являющуюся мишенью, может привести к ложным выводам относительно биологии целевого организма, таких как метаболический потенциал и события горизонтального переноса генов (HGT) между видами.Позже было показано, что несколько сообщений о HGT в геномах эукариот были основаны на необнаруженном загрязнении сборок. Выявление контаминации может радикально изменить выводы исследования, как это показано для морской ветреницы Nematostella vectensis (Artamonova & Mushegian, 2013) и тихоходки Hypsibius dujardini (Koutsovoulos et al ., 2016). Важно отметить, что необнаруженное загрязнение опубликованных геномов нецелевыми последовательностями приведет к загрязнению общедоступных баз данных последовательностей и будет способствовать распространению ошибок аннотации.

Надежное отнесение последовательности ДНК из новой сборки к ее виду происхождения, i. е. привязка идентификатора последовательности к уникальному числовому идентификатору (TaxID) из базы данных таксономии Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (Federhen, 2012) является нетривиальной проблемой. Текущие конвейеры скрининга загрязняющих веществ основаны на сходстве последовательностей с последовательностями известного происхождения, сигнатурах состава последовательностей, таких как k -меры, и / или общих профилях охвата в разных наборах данных.Немногие из них легко применимы к наборам данных эукариотических геномов любого размера (Eren et al ., 2015; Kumar et al ., 2013; Mallet et al ., 2017; Tennessen et al ., 2016). Anvi’o (Eren et al ., 2015) разделяет сборки путем кластеризации последовательностей на основе выходных данных CONCOCT (Alneberg et al ., 2014). CONCOCT использует модели смеси Гаусса для прогнозирования принадлежности последовательностей к кластерам, учитывая состав последовательностей и профили покрытия.PhylOligo (Mallet et al ., 2017) полагается исключительно на композицию последовательностей и выполняет итеративную, частично контролируемую кластеризацию последовательностей на основе профилей композиции последовательностей. ProDeGe (Tennessen et al ., 2016) использует полностью неконтролируемый метод, основанный на сходстве последовательностей с базами данных и композиции последовательностей для секционирования сборок с использованием анализа главных компонентов (PCA). Следует отметить, что, хотя таксономическое присвоение на основе состава последовательностей более высокого порядка (например, k -меров длиной 4 или более) является высокоэффективным для бактериальных последовательностей, его успех был ограничен для геномов эукариот, поскольку содержание информации, представленное по количеству кодирующих оснований ниже, а спектры состава последовательностей часто показывают мультимодальное распределение (Chor et al ., 2009).

Существующие трубопроводы для фильтрации загрязняющих веществ также различаются по способу представления результатов. Anvi’o отображает сборки с помощью интерактивных графиков с обширными аннотациями функций композиции последовательностей, покрытиями по наборам данных и результатами таксономии / биннинга. PhylOligo предлагает тепловые карты иерархической кластеризации последовательностей, древовидную визуализацию и графики t-SNE (t-распределенное стохастическое соседнее встраивание), где кластеризация композиции последовательностей сокращена до двух измерений.ProDeGe отображает последовательности в интерактивных трехмерных k -мерных графиках PCA.

BlobPlots, или графики GC-покрытия с аннотациями таксонов (Kumar et al. ., 2013) — еще одна методология обнаружения загрязнения и разделения данных. BlobPlots — это двумерные диаграммы разброса, на которых последовательности представлены точками и окрашены в соответствии с таксономической принадлежностью на основе результатов поиска по сходству последовательностей. Для каждой последовательности положение на оси Y определяется базовым покрытием последовательности в библиотеке покрытия, которое является показателем молярности входной ДНК.Положение на оси X определяется содержанием GC, соотношением оснований G и C в последовательности, которые могут существенно различаться в разных геномах.

Здесь мы представляем BlobTools, модульное решение командной строки для визуализации сборок генома в виде BlobPlots и таксономического опроса в целях контроля качества. BlobTools — это полная реализация конвейера Blobology (Kumar et al ., 2013), сфокусированная на удобстве использования, улучшенном таксономическом назначении последовательностей на основе пользовательского ввода и поддержке информации о покрытии на основе нескольких форматов и библиотек секвенирования.Мы демонстрируем возможности BlobTools с использованием синтетических наборов данных и предлагаем рекомендации по эффективному внедрению BlobTools в программы сборки генома.

Методы

Реализация

BlobTools написан на Python и состоит из основного исполняемого файла, который позволяет пользователю взаимодействовать с реализованными модулями (см. Таблицу 1). Он предлагает простой модульный интерфейс командной строки, который можно легко адаптировать для одновременной обработки нескольких наборов данных с помощью параллельного интерфейса GNU (Tange, 2011).Входные данные для BlobTools — это стандартные форматы файлов, обычно создаваемые в ходе проектов сборки генома. Основная обработка в BlobTools создает структуру данных BlobDB на основе пользовательского ввода. Из этой структуры данных BlobTools генерирует легко интерпретируемые двухмерные визуализации, готовые к публикации, в сочетании с табличным выводом, позволяя пользователю разбивать последовательности и сопряженные чтения (PE), участвующие в них, для отдельной последующей обработки. Мы представляем два рекомендуемых рабочих процесса: один нацелен на проекты сборки de novo генома в отсутствие эталонного генома (рис. 1A), а другой — для проектов, в которых доступен эталонный геном (рис. 1B).

Таблица 1. Задачи, выполняемые модулем BlobTools.

идентификаторов последовательностей
Модуль BlobTools
Задача
создать Разбор входных файлов и создание данных BlobTools (JSON)
структура, i. е . BlobDB
вид Генерация табличного вывода для ручной проверки и
последующего разбиения последовательностей в сборке, ввод файлов
для CONCOCT и / или файлов COV на основе BlobDB
график Графики BlobPlots на основе BlobDB
covplot Построение графиков CovPlots на основе BlobDB и файла COV
seqfilter Разделение последовательностей из файла FASTA на основе списка
Разделение парных операций чтения из файла BAM на основе списка
идентификаторов последовательностей и их поведения сопоставления
map2cov Создание файла COV (содержащего покрытие базы и чтения
) на основе файла BAM / CAS
taxify Аннотация результатов поиска подобия табличной последовательности ( e.г .
BLAST / Diamond output) с TaxID из файла сопоставления или
создание файла совпадений BlobTools на основе пользовательского ввода

Рис. 1. Два общих рабочих процесса BlobTools для таксономического опроса наборов данных с парным концом (PE).

( A ) Рабочий процесс A. Нацелен на новых проектов сборки генома при отсутствии эталонного генома. 1: Создание структуры данных BlobDB на основе входных файлов. 2: Визуализация сборки и создание табличного вывода.3: Разделение идентификаторов последовательностей в сборке на основе определяемых пользователем параметров, полученных с помощью визуализаций. 4: Разделение чтения PE на основе идентификаторов последовательностей. ( B ) Рабочий процесс B. Нацелен на проекты, в которых доступен эталонный геном. 1: чтения сопоставлены с эталонным геномом. 2: файл BAM обрабатывается для создания файлов FASTQ на основе поведения сопоставления чтения. 3: FASTQ файл пар чтения, где ни одна карта чтения в эталонный геном (UnUn) не собрана de novo и используется в рабочем процессе A.4: разбиение пар чтения целевого таксона, восстановленного из рабочего процесса A, собирается вместе с другими парами чтения целевого таксона из шага 2 и используется в рабочем процессе A.

Назначение таксономии

Назначение таксономии в BlobTools основано на заданном пользователем, вкладка Файлы с разделенными значениями (TSV), состоящие из трех столбцов: ID входной последовательности, NCBI TaxID и числовой балл. Мы называем эти файлы TSV ниже как файлы «обращений». Они могут быть сгенерированы на основе результатов поиска сходства последовательностей, такого как BLAST (Camacho et al ., 2009) или Diamond blastx (Buchfink et al ., 2015) поиск по общедоступным или справочным базам данных или по результатам других инструментов идентификации загрязнителей. Модуль Taxify BlobTools позволяет легко преобразовывать табличные форматы файлов в входные данные, совместимые с BlobTools, в дополнение к аннотации результатов поиска по сходству на основе файлов сопоставления NCBI TaxID, доступных в UniProt и NCBI.

На основе этих входных данных BlobTools назначает единую таксономию NCBI для каждой последовательности в сборке на основе NCBI TaxID с наивысшей оценкой в ​​следующих таксономических рангах: вид, род, семейство, порядок, тип и суперкоролевство.Подсчет баллов может контролироваться пользователем с помощью минимального порога баллов (—min_score) и минимальной разницы в баллах (—min_diff) между лучшей и второй лучшей таксономией оценки. Кроме того, возможны три неканонических таксономических аннотации: «no-hit», суффикс «-undef» и «unresolved». Последовательности, не отнесенные к какой-либо таксономической группе или не превышающие порог —min_score, помечаются как «no-hit». Если NCBI TaxID не имеет явного родителя в таксономическом ранге, суффикс «-undef» добавляется к следующему более высокому таксономическому рангу, для которого он существует.В случаях, когда разница в баллах между лучшими и вторыми совпадениями меньше, чем —min_diff, последовательности помечаются как «неразрешенные».

В качестве входных данных можно предоставить несколько файлов «совпадений». В этом случае процесс присвоения таксономии можно контролировать с помощью «налоговых правил». Таксономия с наивысшей оценкой может быть выведена для всех файлов (‘bestsum’) или последовательно (‘bestsumorder’) в том порядке, в котором они были введены в качестве входных данных, что позволяет рассматривать только последовательность, которая не получила совпадений из одного файла, для таксономической аннотации в следующий файл, тем самым повышая надежность оценок различных источников входных файлов.

Исходный конвейер blobology (Кумар и др. ., 2013) рекомендовал использование одного наилучшего попадания BLAST на последовательность для назначения таксономии. Однако таксономически неверно аннотированные последовательности в базах данных (полученные из-за включения неотобранных геномных сборок) могут привести к ошибочной таксономической аннотации. BlobTools смягчает эту проблему, принимая несколько совпадений для каждой последовательности и выделяя таксономию на основе максимальной суммы баллов.

Следует отметить, что окончательное таксономическое размещение каждой последовательности в сборке не требуется для успешного таксономического разделения последовательностей, поскольку часто бывает достаточно дифференциального охвата и профилей состава последовательностей между геномами.

Визуализации

В BlobTools последовательности изображаются в виде кругов на BlobPlots (в отличие от точек в конвейере blobology) с диаметром, пропорциональным длине последовательности. Диаграмма рассеяния украшена гистограммами охвата и GC для каждой таксономической группы, которые взвешены по общему диапазону (совокупной длине) последовательностей, занимающих каждую ячейку. Легенда отражает таксономическую принадлежность последовательностей и перечисляет количество, общий диапазон и N50 по таксономической группе. Таксономические группы могут быть нанесены на график любого таксономического ранга, а цвета динамически выбираются из цветовой карты.Количество таксономических групп, которые должны быть нанесены на график, можно контролировать (—plotgroups, по умолчанию «7»), а остальные группы объединяются в категорию «другие». Пример показан на рисунке 2A.

Рисунок 2. Визуализация объединенной сборки симулированных библиотек секвенирования.

( A ) BlobPlot сборки. Последовательности в сборке изображены в виде кругов с диаметром, масштабированным пропорционально длине последовательности и окрашенным таксономической аннотацией (в ранге ’order’) на основе результатов поиска сходства BLASTn и Diamond blastx, предоставленных в этом порядке и с использованием taxrule ’bestsumorder’.Кружки расположены на оси X в зависимости от их доли GC и на оси Y на основе суммы покрытия как библиотеки A, так и библиотеки B. ( B ) ReadCovPlot библиотеки A. ( C ) ReadCovPlot of библиотека B. В ReadCovPlots отображенные чтения показаны по таксономической группе в ранге «порядок».

Мощность профилей дифференциального покрытия в разных библиотеках секвенирования для разделения последовательностей в сборке побудила к разработке CovPlots (рисунок 3) (Koutsovoulos et al ., 2016), которые аналогичны BlobPlots, за исключением того, что ось GC заменена осью покрытия из другой библиотеки секвенирования. CovPlots можно использовать для визуализации шаблонов сигнатур дифференциального покрытия между таксономическими группами в сборке.

Рисунок 3. CovPlot объединенной сборки симулированных библиотек секвенирования.

Последовательности в сборке изображены в виде кругов с диаметром, масштабированным пропорционально длине последовательности и окрашенным таксономической аннотацией (в ранге «порядок») на основе результатов поиска сходства BLASTn и Diamond blastx, представленных в этом порядке и с использованием taxrule «bestsumorder» ‘.Круги расположены на оси X на основе покрытия в библиотеке A и на оси Y на основе покрытия в библиотеке B. Параметры для разделения последовательностей в сборке (которые были применены к табличному представлению BlobDB) обозначены как пунктирные серые линии и текстовые примечания на точечной диаграмме.

Модули для создания BlobPlots и CovPlots поддерживают дополнительные входные параметры, управляющие поведением визуализации, включая кумулятивное добавление (—cumulative) или создание отдельных графиков для каждой таксономической группы (—multiplot), исключения (—exclude) или перемаркировки (- -relabel) таксономических групп, присвоение группам определенных цветов HEX (—colour) или маркировка последовательностей на основе произвольных, определенных пользователем категорий (—catcolour).Последние могут быть, например, объединенными категориями отображений RNAseq в последовательности в сборке, как показано в Koutsovoulos et al . (2016).

ReadCovPlots (рис. 2B и 2C) визуализируют долю операций чтения библиотеки, которые не сопоставлены или сопоставлены, показывая процент сопоставленных операций чтения по таксономической группе в виде столбчатых диаграмм. Они могут быть полезны для быстрого таксономического скрининга нескольких библиотек секвенирования в рамках одного проекта. Базовые данные ReadCovPlots и дополнительные метрики записываются в табличные текстовые файлы для пользовательского анализа.

Поддержка нескольких библиотек покрытия

BlobTools поддерживает ввод покрытия (формат BAM / CAS) из нескольких библиотек секвенирования. Поскольку эти форматы данных содержат больше информации, чем необходимо, BlobTools анализирует информацию о покрытии последовательностей (нормализованное базовое покрытие и покрытие для чтения) в файлы COV в формате TSV. Эти файлы могут быть сгенерированы с помощью модуля map2cov до создания BlobDB.

В структуре данных BlobDB базовая информация и информация о читаемом покрытии хранятся для каждой последовательности в сборке.Если предоставлено более одного файла покрытия, BlobTools создает внутреннюю библиотеку дополнительного покрытия (cov_sum), содержащую сумму покрытий для каждой последовательности во всех файлах покрытия. Эта библиотека внутреннего покрытия учитывается при извлечении видов или построении визуализаций.

Operation

Системные требования для BlobTools включают операционную систему на основе UNIX, Python 2.7 и pip. Предоставляется сценарий установки, который устанавливает зависимости Python, загружает и обрабатывает копию NCBI TaxDump, а также загружает и компилирует копию samtools (Li et al ., 2009). Инструкции по установке и запуску BlobTools можно найти по адресу https://github.com/DRL/blobtools.

Два общих рабочих процесса BlobTools для таксономического опроса наборов данных чтения с парным концом (PE) изображены на блок-схеме на рисунке 1. Рабочий процесс A нацелен на de novo проектов сборки генома, где нет существующего эталонного генома. При наличии эталонного генома следует следовать рабочему процессу B.

Рабочий процесс A (рисунок 1A) проходит через построение структуры данных BlobDB на основе входных файлов (шаг A1), визуализацию сборки и генерацию табличного вывода (A2), разбиение идентификаторов последовательностей на основе определяемых пользователем параметров, проинформированных визуализацией. (A3) и разделение считываний PE на основе идентификаторов последовательностей (A4).Следует отметить, что, хотя модуль создания BlobTools (шаг A1) поддерживает несколько форматов сопоставления, рекомендуется, чтобы они были обработаны заранее с помощью map2cov. Создание табличных файлов «совпадений» упрощается за счет модуля taxify, который позволяет аннотировать результаты поиска по сходству на основе файлов сопоставления TaxID или на основе пользовательского ввода в табличном формате.

BlobTools может обрабатывать файлы как PE, так и файлы одностороннего чтения. Модуль bamfilter на шаге A4 имеет значение только в том случае, если используются данные чтения PE, поскольку данные чтения с одного конца могут быть легко разделены с помощью GNU grep или других инструментов.Модулем bamfilter можно управлять с помощью списка идентификаторов последовательностей, которые нужно включить или исключить. Использование списка исключений приводит к включению всех идентификаторов последовательностей, кроме указанных. В обоих случаях он будет выводить до четырех чередующихся файлов FASTQ в зависимости от фактического поведения сопоставления пар чтения и наличия параметра —include_unmapped. Возможные варианты поведения при отображении пар чтения: оба чтения отображаются во включенные последовательности (включенные-включенные: InIn), одно отображение чтения во включенную последовательность, а другое не отображается (InUn), и одно отображение чтения во включенную последовательность, а другое отображение в исключенную последовательность (ExIn).Если указан параметр —include_unmapped, модуль также записывает пары чтения, в которых ни одно чтение не сопоставляется со сборкой (UnUn). Последний случай может произойти, если ассемблер, используемый для генерации последовательностей, не использовал все операции чтения в наборе данных. Полученные в результате секционированные файлы чтения PE могут быть затем собраны отдельно, и рабочий процесс повторяется. Решение о том, какие файлы чтения PE использовать, остается на усмотрение пользователя. Однако, как правило, если целевые таксоны были секвенированы при низких покрытиях, может быть предпочтительнее быть инклюзивным (с использованием файлов InIn, InEx, InUn и UnUn FASTQ для сборки) и с риском включения нецелевых операций чтения, чем быть эксклюзивным (с использованием только InIn и InUn для сборки) и рискует потерять значительную долю операций чтения из целевых геномов.

Рабочий процесс B (рисунок 1B) следует применять, когда доступен эталонный геном. Чтения сопоставляются с эталонным геномом (B1), и полученный файл BAM обрабатывается модулем bamfilter (B2) с использованием параметра —include_unmapped и без предоставления списка последовательностей. В результате получатся три файла FASTQ: InIn, InUn и UnUn. Поскольку таксономическое происхождение чтений InIn и InUn было установлено на этапе сопоставления, только чтения UnUn собираются de novo (B3) и обрабатываются с помощью рабочего процесса A.Это существенно снижает вычислительные требования. Если рабочий процесс A дает раздел чтения PE целевого организма, который будет состоять из частей генома организма, не представленных в ссылке, эти чтения могут использоваться вместе с InIn и InUn чтения с шага 2 для создания новой сборки ( B4), который следует снова проверить с помощью рабочего процесса A. Эту итеративную процедуру можно легко применить к проектам, изучающим сильно изменчивые виды, где сегментарное присутствие-отсутствие является обычным явлением, а эталонный геном расширяется (для формирования пангенома) по мере секвенирования новых образцов, или холобиомы, в которых эталонные геномы нескольких таксонов расширяются по мере добавления новых образцов.

Сценарии использования

Подробное описание используемых программ и команд можно найти в дополнительном файле 1.

Данные

Чтобы проиллюстрировать рабочий процесс A (рисунок 1A), мы смоделировали библиотеки чтения для нематоды Caenorhabditis elegans , зараженной другие организмы (см. таблицу 2). Библиотека A содержит считываний C. elegans , загрязненных считываниями из Escherichia coli , Homo sapiens хромосомы 19 и митохондриального генома (мтДНК) H. sapiens , имитируя набор данных, где целевой геном загрязнен ДНК из пищи ( Э.coli ) и оператор ( H. sapiens ). Библиотека B состоит из C. elegans, прочтений, зараженных Pseudomonas aeruginosa , имитируя проект, в котором целевой вид многоклеточных животных в значительной степени колонизируется прокариотическим организмом.

Таблица 2. Имитированные библиотеки чтения.

Набор данных Контрольный геном Доступ к INSDC Охват (X)
Библиотека A C.elegans N2 GCA_000002985.3 50
E. coli str. К-12 подл. MG1655 GCA_000801205 25
H. sapiens chr19 GRCh48.p10 GCA_000001405.25 10
.
Библиотека B C. elegans N2 GCA_000002985.3 25
P. aeruginosa PAO1 GCA_000006765.1 100

Таксономический запрос и разбиение пар считывания с использованием библиотеки BlobTools

и сопоставленных данных, сопоставленных по отдельности и сопоставленных с каждой библиотекой данных, собранных вместе с библиотеками данных для чтения

. Ассамблея. Мы предоставили сборку BlobTools в дополнение к информации о покрытии, извлеченной из обоих файлов BAM, и результатов поиска сходства последовательностей.

Чтобы смоделировать случаи, когда последовательности геномов в сборке не являются частью общедоступных баз данных последовательностей, мы удалили все последовательности, аннотированные под таксономическими терминами «Caenorhabditis elegans», «Hominids», «Escherichia», «Pseudomonas» и «Другие последовательности». ‘перед проведением поиска сходства последовательностей.Результаты поиска, предоставленные BlobTools, включали поиск BLASTn megablast против NCBI nt (-outfmt ‘6 qseqid staxids bitscore std’ -max-target-seqs 1 -max_hsp 1 -evalue 1e-25) и поиск Diamond blastx против эталонных протеомов UniProt (- Outfmt 6 —sensitive —max-target-seqs 1 —evalue 1e-25), поставляемый в этом порядке и использующий правило taxrule ‘bestsumorder’.

BlobPlot (Рисунок 2A), ReadCovPlots (Рисунок 2B и C) и CovPlot (Рисунок 3) были созданы с таксономическим рангом ’order’. Табличное представление BlobDB было сгенерировано с использованием представления модуля под налоговым правилом ‘bestsumorder’ и для таксономических рангов ‘superkingdom’, ‘phylum’ и ‘order’.Мы разделили последовательности на основе дифференциального охвата и аннотации таксономии (рисунок 3), используя табличное представление и инструменты UNIX: GNU grep, GNU cut и GNU awk. Впоследствии пары чтения были разделены на основе поведения сопоставления с этими разделами последовательностей с использованием модуля bamfilter и пары чтения, где оба считывания, сопоставленные с включенными последовательностями (, т.е. набор InIn), были собраны по таксономической группе.

Затем мы создали BlobPlots для четырех сборок (названных «rhabditida-BT», «primates-BT», «pseudomonadales-BT» и «enterobacterales-BT») (рис. 4).Информация о покрытии была основана на сопоставлении обеих смоделированных библиотек секвенирования со всеми четырьмя сборками, а последовательности были окрашены в соответствии с геномом происхождения сопоставленных имитированных считываний.

Рис. 4. BlobPlots сборок по таксонам после разбиения на чтение с помощью BlobTools.

Покрытие было получено путем сопоставления исходных операций чтения сборкам. Последовательности таксономически аннотируются «истинной» таксономией, основанной на происхождении отображаемых им симулированных чтений. Последовательности, помеченные как ‘no-hit’, не получали сопоставленных операций чтения.( A ) Собрание раздела Рабдитиды читается (’рабдитида-BT’). Осталась одна последовательность P. aeruginosa (охват 4886 нуклеотидов). ( B ) Сборка раздела приматов читает (’приматы-BT’). Осталось пять последовательностей E. coli (общий охват 3838 нуклеотидов). ( C ) Сборка раздела Pseudomonadales читает (’pseudomonadales-BT’). ( D ) Сборка раздела Enterobacterales читает (’enterobacterales-BT’). Остается одна последовательность из P. aeruginosa (размах 254 нуклеотида).

Оценка результатов

Очищенные сборки были оценены на основе количества смоделированных считываний, генома происхождения, сопоставления с ними (таблица 3) и на основе стандартных метрик сборки (таблица 4).

Таблица 3. Процент чтения (с разбивкой по таксономическому происхождению), сопоставленных с последовательностями в каждой из обработанных BlobTools сборок (суффикс «-BT»).

* : чтения, которые не сопоставлены ни с одной последовательностью, перечислены в разделе «Не сопоставлено». Жирный шрифт: сопоставлено нулевое количество чтений.

01
Таксономическое
происхождение модели

прочтений
Сопоставление с
rhabditida-BT
(%)
Сопоставление с
приматами-BT
(%)
Сопоставление с

-BT (%) Сопоставление с
enterobacterales-BT
(%)

Не сопоставлено

(%)
C. elegans 99,99 0,00 0,00 0,00
H. sapiens 0,02 99,33 0,00 0,00 0,66
P.S.
E. coli 0,72 0,22 0,06 98,64 0,35

Для учета систематических ошибок сборки и сопоставления исходные имитированные наборы для чтения также были собраны отдельно с помощью налоговой системы. сборки CELEG-SIM (читается смоделировано с C.elegans генома), HSAPI-SIM (считывает моделирование из хромосомы 19 и мтДНК H. sapiens), PAERU-SIM (считывает моделирование из генома P. aeruginosa ) и ECOLI-SIM (считывает моделирование из E. coli геном).

Мы оценили влияние параметров поиска сходства в общедоступных базах данных на таксономическую аннотацию с помощью BlobTools (см. Дополнительный файл 2). Поскольку исчерпывающий поиск в больших базах данных требует времени и вычислительной мощности, мы сосредоточились на параметрах, которые ограничивают использование ресурсов и контролируют количество возвращаемых результатов.И в BLASTn, и в Diamond blastx реализованы параметры -max-target-seq и -max-hsps. Первый — это ранний фильтр, применяемый во время первичного поиска и исключающий первые совпадения из более поздней проверки. Последний контролирует количество высоко оцененных пар (HSP), сообщаемых между запросом и предметом поиска. Специфический для BLAST параметр -culling-limit управляет количеством совпадений, которые могут быть выделены для данной области запроса. Для этого набора данных лучший компромисс между ложноположительными и ложноотрицательными таксономическими аннотациями был достигнут путем объединения поиска BLAST (-max-target-seqs 10 -evalue 1e-25) с NCBI nt с поисками Diamond blastx (—evalue 1e- 25 —max-target-seqs 1) против эталонных протеомов UniProt в указанном порядке с использованием таксоправила BlobTools ‘bestsumorder’.Однако гораздо более быстрый поиск с приемлемым результатом был достигнут путем изменения параметров BLASTn на -max-target-seqs 1 -max_hsps 1.

Резюме

Мы представили конвейер BlobTools и проиллюстрировали основной рабочий процесс BlobTools (рисунок 1A) с помощью успешное выделение пар чтения из двух смоделированных наборов данных, состоящих из геномов многоклеточных животных и бактерий. Небольшая часть пар чтения, которые получили ошибочное таксономическое назначение или были исключены на этапе разделения (Таблица 3), мало повлияла на общий успех сборки для каждого таксона (Таблица 4).Результат можно было бы еще больше улучшить, если бы он был более инклюзивным на этапе разделения последовательностей (для уменьшения количества неназначенных пар чтения) в сочетании со вторым раундом рабочего процесса BlobTools A (для удаления пар чтения, которые были разделены на неправильную таксономическую группу. ).

Таблица 4. Метрики эталонных геномов (суффикс «-REF»), сборок, созданных из имитированных считываний таксоном (суффикс «-SIM»), и сборок, созданных из считываний, разделенных с помощью конвейера BlobTools (суффикс «-BT»).

933,686401 9356 9359 01
Метрическая CELEG-
REF
CELEG-
SIM
rhabditida-
BT
HSAPI-
REF
HSAPI- 912- 936 936 936 HSAPI14- 912- 936 936 SIMER REF PAERU-
SIM
pseudomonadales-
BT
ECOLI-
REF
ECOLI-
SIM
энтеробактерии-
BT
58634185 50765888 50660776 6264404 6221846 6215193 4636831 4561104 4534517
Количество 7 5536 5616 2 12700 12504 1 58 52 1 87 66
N50 (б) 174 +51178 50209 58617616 8186 8200 6264404 333929 426963 4636831 148391 151 538
GC ( %) 35.4 35,4 35,4 47,9 48,4 48,4 66,6 66,6 66,6 50,8 50,7 50,71412 50,7 50,712
97,8 92,7 92,8 3,1 1,5 1,6 98,2 98,2 98,2 99,5 дублированный 99,5 99172
963% )
0.6 0,4 0,4 0,1 0 0 0,2 0,4 0,4 0 0 0
BUSCO

9

5,5 4,6 0,6 1 1 0 0 0 0,4 0,4 0,6
% BUSCO
(отсутствует) 0.8
1,4 2,2 96,2 97,5 97,4 1,6 1,4 1,4 0,1 0,1 0,2
легкость интерпретации Blob для 9000 favb. , а текущая реализация BlobTools была успешно применена к проектам генома с участием тихоходок (Koutsovoulos et al ., 2016; Yoshida et al ., 2017), мучнистых червецов и их эндосимбионтов (Husnik & McCutcheon, 2016), эктопаразитарных клещей. (Донг и др. ., 2017), двукрылых (Dikow et al ., 2017), медоносных пчел и их метагеномов (Gerth & Hurst, 2017), нематод (Eves-van den Akker et al ., 2016; Gawryluk et al ., 2016; Slos et al ., 2017; Szitenberg et al ., 2017), бактерии (Fuller et al ., 2017; Mellbye et al ., 2017; Samad et al ., 2016; Wang & Chandler, 2016), бабочки (Nowell et al ., 2017), грибковый патоген ячменя (McGrann et al ., 2016) и грибов (Compant et al ., 2017).

BlobTools — удобное и надежное решение для визуализации, контроля качества и таксономического разделения наборов данных генома. Более широкое внедрение скрининга BlobTools исследовательским сообществом поможет контролировать приток таксономически неверно аннотированных последовательностей в общедоступные базы данных последовательностей и предотвратить неточные биологические выводы, основанные на зараженных сборках генома.

Доступность программного обеспечения и данных

Исходный код BlobTools: https: // github.com / DRL / blobtools

Архивный исходный код на момент публикации: http://doi.org/10.5281/zenodo.833879 (Laetsch et al ., 2017)

Лицензия: GNU-GPL

Обзор всех анализов в этом исследовании размещен на https://github.com/DRL/blobtools_manuscript вместе с дополнительным кодом и результирующими выходными файлами.

Конкурирующие доли

Конкурирующие доли участия не были раскрыты.

Информация о гранте

DRL было поддержано стипендией Института Джеймса Хаттона / Школы биологических наук Эдинбургского университета.MLB был поддержан исследовательским грантом BBSRC (номер проекта BB / P024238 / 1).

Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Blaxter Nematode and Neglected Genomics в Эдинбурге за поддержку, критику и предложения. Мы благодарим Георгиоса Куцовулоса, Суджаи Кумара, Тима Бута и Джейсона Стаджича за вклад в базу кода BlobTools.Мы благодарим Карлоса Карселя и Суджая Кумара за комментарии к рукописи. Мы благодарим Джудит Рисс и команду Edinburgh Genomics за запросы функций и внедрение BlobTools в их конвейер контроля качества. Мы благодарим всех пользователей GitHub, которые подняли вопросы, проблемы и отправили запросы функций.

Дополнительный материал

Дополнительный файл 1: Дополнительные методы.

Щелкните здесь, чтобы получить доступ к данным.

Дополнительный файл 2: Дополнительные результаты, в том числе:

  • Таблица S1: F-баллы для оценки влияния параметров поисков BLASTn на поиски NCBI nt и Diamond blastx на ссылочные протеомы UniProt на таксономическое назначение BlobTools .

  • Таблица S2: Точность и отзывчивость для оценки влияния параметров поисков BLASTn на поиски NCBI nt и Diamond blastx против эталонных протеомов UniProt на таксономическое назначение BlobTools.

  • Таблица S3: Количество истинно положительных (TP), ложноположительных (FP), истинно отрицательных (TN) и ложноотрицательных (FN) оснований для оценки влияния параметров поиска BLASTn на NCBI nt и Diamond blastx выполняет поиск по ссылочным протеомам UniProt по таксономическому назначению с помощью BlobTools.

Щелкните здесь, чтобы получить доступ к данным.

F1000 рекомендуется

Ссылки

  • Alneberg J, Bjarnason BS, de Bruijn I, et al. : Объединение метагеномных контигов по охвату и составу. Нат. Методы. 2014; 11 (11): 1144–1146. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • Артамонова И.И., Мушегян А.Р. Анализ геномной последовательности показывает, что модельный эукариот Nematostella vectensis является носителем бактериальных консортов. Appl Environ Microbiol. 2013; 79 (22): 6868–6873. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Buchfink B, Xie C, Huson DH: быстрое и чувствительное выравнивание белков с помощью алмаза. Нат. Методы. 2015; 12 (1): 59–60. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • Camacho C, Coulouris G, Avagyan V, et al. : Blast +: архитектура и приложения. BMC Bioinformatics. 2009; 10 : 421.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Chor B, Horn D, Goldman N, et al. : Спектры геномной ДНК k -мера: модели и модальности. Genome Biol. 2009; 10 (10): R108. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Compant S, Gerbore J, Antonielli L, et al. : Проект последовательности генома корневого колонизирующего гриба Trichoderma harzianum B97. Genome Announc. 2017; 5 (13): pii: e00137–17.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Dikow RB, Frandsen PB, Turcatel M, et al. : Геномные и транскриптомные ресурсы для мух-убийц, включая полную последовательность генома Proctacanthus coquilletti (Insecta: Diptera: Asilidae) и 16 репрезентативных транскриптомов. PeerJ. 2017; 5 : e2951. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Dong X, Armstrong SD, Xia D, et al.: Проект генома эктопаразитического клеща медоносной пчелы, Tropilaelaps mercedesae , сформирован историей жизни паразита. Gigascience. 2017; 6 (3): 1–17. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Eren AM, Esen ÖC, Quince C, et al. : Anvi’o: платформа для расширенного анализа и визуализации данных omics. PeerJ. 2015; 3 : e1319. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Eves-van den Akker S, Laetsch DR, Thorpe P, et al.: Геном желтой картофельной нематоды, Globodera rostochiensis , раскрывает основы паразитизма и вирулентности. Genome Biol. 2016; 17 (1): 124. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Federhen S: База данных таксономии NCBI. Nucleic Acids Res. 2012; 40 (выпуск базы данных): D136–43. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Fuller SL, Savory E, Weisberg AJ, et al.: Изотермическая амплификация и анализ бокового потока для обнаружения коронкового галла Agrobacterium spp. Фитопатология. 2017. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • Гаврилюк Р.М., Дель Кампо Дж., Окамото Н., и др. : Морфологическая идентификация и одноклеточная геномика морских диплонемид. Curr Biol. 2016; 26 (22): 3053–3059. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • Gerth M, Hurst GDD: Краткие отрывки из медоносной пчелы ( Apis sp.) проекты секвенирования отражают разнообразие ассоциированных микробов. PeerJ. 2017; 5 : e3529. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR: Достигнув совершеннолетия: десять лет технологий секвенирования следующего поколения. Nat Rev Genet. 2016; 17 (6): 333–351. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • Husnik F, McCutcheon JP: Повторная замена внутрибактериального симбионта в трехчастном симбиозе вложенного мучнистого червеца. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2016; 113 (37): E5416–24. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Куцовулос Г., Кумар С., Лаэтч Д.Р., и др. : Нет доказательств обширного горизонтального переноса генов в геноме тихоходки Hypsibius dujardini . Proc Natl Acad Sci U S. A. 2016; 113 (18): 5053–5058. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Kumar S, Jones M, Koutsovoulos G, et al.: Блобология: исследование необработанных данных генома для загрязнителей, симбионтов и паразитов с использованием аннотированных таксонами графиков охвата GC. Front Genet. 2013; 4 : 237. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Laetsch DR, Koutsovoulos G, Booth T, et al. : DRL / blobtools: BlobTools v1.0. Zenodo. 2017. Источник данных
  • Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. : Формат выравнивания / карты последовательностей и samtools. Биоинформатика. 2009; 25 (16): 2078–2079. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Mallet L, Bitard-Feildel T, Cerutti F, et al. : PhylOligo: пакет для идентификации загрязняющих или нецелевых последовательностей организмов в геномных сборках. Биоинформатика. 2017. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • McGrann GR, Andongabo A, Sjökvist E, et al. : Геном развивающегося патогена ячменя Ramularia collo-cygni . BMC Genomics. 2016; 17 : 584. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Mellbye BL, Davis EW 2nd, Spieck E, et al. : Проект последовательности генома Nitrobacter vulgaris Штамм Ab 1 , нитрит-окисляющая бактерия. Genome Announc. 2017; 5 (18): pii: e00290-17. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Nowell RW, Elsworth B, Oostra V, et al. : черновой вариант генома микалезиновой бабочки с высоким охватом Bicyclus anynana . Gigascience. 2017; 6 (7): 1–7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Samad A, Trognitz F, Antonielli L, et al. : Высококачественная предварительная последовательность генома эндофитного штамма Pseudomonas viridiflava с гербицидными свойствами в отношении своего хозяина, сорняка Lepidium draba L. Genome Announc. 2016; 4 (5): pii: e01170–16. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Slos D, Sudhaus W, Stevens L, et al.: Caenorhabditis monodelphis sp. n .: определение морфологии и геномики стебля рода caenorhabditis . BMC Zool. 2017; 2 (1): 4. Publisher Full Text
  • Szitenberg A, Salazar-Jaramillo L, Blok VC, et al. : Сравнительная геномика апомиктических корневых нематод: гибридизация, плоидность и динамическое изменение генома. BioRxiv. 2017. Издатель Полный текст.
  • Tange O: GNU parallel — инструмент командной строки. логин: журнал USENIX . 2011; 36 (1): 42–47. Справочный источник
  • Tennessen K, Andersen E, Clingenpeel S, et al. : ProDeGe: вычислительный протокол для полностью автоматизированной дезактивации геномов. ISME J. 2016; 10 (1): 269–272. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • Ван И, Чендлер С: Островки-кандидаты патогенности в геноме « Candidatus rickettsiella isopodorum», внутриклеточной бактерии, заражающей наземных ракообразных-изопод. PeerJ. 2016; 4 : e2806. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • Yoshida Y, Koutsovoulos G, Laetsch DR, et al. : Сравнительная геномика тихоходок hypsibius dujardini и ramazzottius varieornatus. BioRxiv. 2017. Publisher Full Text

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Авторское право © 2021 Es picture - Картинки
top